Цитогенетические нарушения в оценке токсико-генетического риска длительного воздействия малых доз α-излучения

Радон – радиоактивный инертный газ без цвета и запаха, образующийся при распаде 238U. Вклад радона и продуктов его распада в естественный радиационный фон составляет более 60% и более 50% в общую дозу облучения человека [1]. В результате эпидемиологических исследований установлена прямая зависимость риска развития рака легкого от концентрации радона в профессиональных условиях шахт и подземных выработок [2, 3]. В то же время остается спорным вопрос о воздействии радона в воздухе жилых и общественных помещений. Экспозиция радоновым излучением пропорциональна времени проводимому в помещении и максимальна в зимнее время, когда помещения реже проветриваются.

Таким образом, проблему можно сформулировать как возможность переноса

Дружинин Владимир Геннадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики модели риска профессионального облучения радоном и продуктами его распада на воздействие более низких концентраций радона в жилых и общественных помещениях. До недавнего времени не было подтверждений данной гипотезы, поскольку для доказательства карциногенного воздействия радона в непроизводственных условиях требовалось собрать большой объем эпидемиологических данных. В работе, объединившей результаты 13 исследований в 9 странах Европы, было показано значительное возрастание риска рака легкого при увеличении концентрации радона в жилых помещениях. По оценке исследователей вклад радона общую смертность от рака легких в Европе составляет около 20000 случаев в год, что соответствует 9% от общей смертности от рака легких и 2% смертности от рака в целом [4].

На фоне этих эпидемиологических данных представляет интерес оценка длительного воздействия малых концентраций радона в жилых помещениях с использованием систем биологической индикации. Очевидные требования к выбору данного метода: 1) чувствительность к радиационному воздействию, особенно α-излучению;

• 2)    возможность интегральной оценки качества окружающей среды; 3) оценка суммарного мутагенного и генотоксического воздействия. Нами выбран цитогенетический метод оценки частоты и спектра структурных аберраций хромосом в кратковременных культурах лимфоцитов крови, как метод, максимально отвечающий выдвинутым критериям. Этот метод рекомендован ВОЗ для осуществления биологической индикации воздействия радиации на популяции человека [5]. Кроме того установлено, что уровень аберраций, регистрируемый в соматических клетках, является биомаркером риска развития рака в будущем [6].

Для проведения исследования была выбрана южная часть Кемеровской области – Горная Шория. Выбор сделан на основе использования метода картографирования цитогенетических эффектов у населения крупных промышленных регионов [7]. В ходе работы были локализованы районы, характеризующиеся неблагоприятной эколого-генетической обстановкой, в частности Горная Шория. В этом районе радиационный фон по данным лаборатории радиологической экспертизы центра Госсанэпиднадзора в пределах нормы. Следует учитывать, что эти данные относятся прежде всего к γ-фону и не исключают возможность воздействия радона. Для оценки воздействия радона как возможного экологического фактора индуцирующего генотоксические и канцерогенные эффекты в организме человека, проведено цитогенетическое обследование детей, проживающих и обучающихся в доме-интернате г. Таштагола. Анализ выполнен в сочетании с радиологическими исследованиями концентрации радона в воздухе жилых и учебных помещений. Выбор детей в качестве обследуемой группы представляется оптимальным ввиду минимального воздействия вредных привычек, а также стандартизованных условий проживания в интернате.

Методы исследования. В работе приведены данные о частоте хромосомных аберраций в 48-часовых культурах лимфоцитов периферической крови у 132 детей – подростков в возрасте 10-19 лет, компактно проживающих в образовательном учреждении интернатного типа, расположенном на территории Таштагольского района Кемеровской области. Половозрастная структура группы представлена в табл. 1.

Таблица 1. Пол и возраст детей-подростков, включенных в исследуемую группу

Индивиды	Число	Возраст ( M ± m )	Вариации возраста
всего:	132	14,2±0,18	10-19
мальчики	66	14,2±0,28	10-19
девочки	66	14,2±0,22	11-19

Подготовку препаратов метафазных хромосом осуществляли с использованием стандартного метода, подробно описанного ранее [8]. Длительность культивирования составляла 48-50 ч. За 2 часа до фиксации в культуры добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. По окончании культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,55% KCl в течение 10-15 мин. при 37оС. Фиксацию материала проводили в 3 сменах охлажденного фиксатора Кларка (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты сушили вблизи пламени спиртовки (не поджигая), шифровали и окрашивали 2% раствором красителя Гимза (Merk). Анализ хромосомных аберраций проводили без карио-типирования. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям [9]. Учитывали четыре основные категории аберраций: хроматидные и хромосомные разрывы (фрагменты); хроматидные и хромосомные обмены. Ахроматические пробелы в число аберраций не включали, а регистрировали отдельно.

Проводились радиологические исследования в местах проживания и обучения детей, включая измерения γ-фона, замеры удельной объемной активности радона в воздухе, суммарной объемной активности α- и β-излучающих радионуклидов, объёмной активности Rn-222 и Cs-137 в пробах водопроводной и питьевой воды и удельной активности радионуклидов (цезий-40, торий-232, калий-40, радий-226) в образцах почв.

Статистическую обработку осуществляли средствами «STATISTICA for WINDOWS 6.0». Использовали методы непараметрической статистики. Сравнение групп осуществляли с помощью рангового U-теста Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение. Результаты изучения хромосомных аберраций в группе детей-подростков из Горной Шории представлены в табл. 2. Для сравнения приведены данные цитогенетического исследования детей-подростков из этого же района, выполненные в 1992 г. [10], а также данные о фоновом уровне хромосомных мутаций в группе жителей экологически чистых деревень в Кемеровском регионе – базисный контроль [11].

Доля аберрантных метафаз в группах детей-подростков из Горной Шории увеличена по сравнению с базисной контрольной группой (p<0,001). Значения отдельных категорий аберраций: хроматидных и хромосомных разрывов, а также обменов хромосомного типа были достоверно выше у жителей Горной Шории в сравнении с базисной контрольной группой. Стабильно высокие значения фоновых цитогенетических нарушений в целом указывают, что на популяцию человека в Горной Шории постоянно воздействуют генотоксические факторы.

Таблица 2. Хромосомные аберрации в группах детей-подростков из Горной Шории: в 2005 г. (данное исследование), в 1992 г. [10] и в базисной контрольной группе [11]

Группа/ год исследования	Изучено индивидов	Доля аберрантных метафаз, %	Число аберраций на 100 клеток
			фрагменты		обмены
			одиночные	парные	хроматидные	хромосомные
Горная Шория 2005	132	4,74±0,21**	2,83±0,16**	1,89±0,14**	0,05±0,02	0,32±0,05**
Горная Шория 1992	28	5,78±0,63**	3,93±0,49*	1,82±0,36*	0,04±0,04	0,32±0,14
Базисная контрольная группа 1986–2001	110	2,86±0,26	2,08±0,22	0,89±0,14	0,04±0,02	0,08±0,03

Достоверно отличается от значений для базисной контрольной группы: * – p<0,01; ** p<0,001.

Особенно важен тот факт, что обмены хромосомного типа (включающие ди-центрические и кольцевые хромосомы) также чаще регистрировались у детей-подростков из Горной Шории как в 1992 г. (0,32±0,14), так и в 2005 г. (0,32±0,05). Известно, что эта категория аберраций является хорошим маркером воздействия радиации. Поэтому мы полагаем, что результаты цитогенетического исследования выборки из Горной Шории в 2005 г. подтверждают гипотезу о том, что основным кластогенным фактором в этом горном районе является радиация [10].

Наличие выраженных кластогенных эффектов (особенно в части радиационных маркеров), стабильно воспроизводящихся в когортах детей-подростков из Горной Шории в сочетании с нормируемыми показателями γ-фона, говорит о необходимости изучения содержания радона. Такое исследование было выполнено в местах проживания и обучения обследованных детей в зимне-весенний период 2007-2008 гг. Результаты трехкратных замеров удельной объемной активности радона, осуществленных в воздухе жилых и учебных помещений школы-интерната г. Таш-тагола, приведены в табл. 3. Для сравнения приведены результаты измерений в двух контрольных сельских населенных пунктах, расположенных в равнинной части Кемеровской области. Концентрация радона в воздухе помещений школы-интерната в зимний период превысила допустимый уровень (до 200 Бк/м3) для эксплуатируемых зданий [12].

Таблица 3. Результаты измерений удельной объемной активности радона, в воздухе жилых и учебных помещений школы-интерната г. Таштагола и в контрольных населенных пунктах

Населенный пункт	Дата измерений	Число точек замеров	Средняя удельная объемная активность радона, Бк/м3, M ± m	Пределы вариаций, Бк/м3 - Бк/м3
г. Таштагол	20.12.2007	11	235±44*	68 – 583
г. Таштагол	06.02.2008	6	415±53*	232 – 617
г. Таштагол	13.05.2008	5	200±42**	101 – 334
с. Красное	25.01.2008	12	106±18	39 – 203
с. Пача	16.05.2008	6	64±22	20 – 135

* – достоверно различается от значения для с. Красное, p=0,008; ** – достоверно различается от значения для с. Пача, p=0,02.

Таким образом, можно говорить о том, что условия проживания и обучения детей-подростков в школе-интернате г. Таштагол не соответствуют санитарноэпидемиологическим нормам по параметрам радиационной безопасности. Вероятно, данная популяция подвержена хроническому воздействию сверхнормативных доз радонового излучения, что в свою очередь может вызывать выраженные генотоксические эффекты, регистрируемые на протяжении долгого времени.

Известно, что у шахтеров урановых или иных шахт, подверженных воздействию высоких доз радонового излучения, уровень цитогенетических повреждений в лимфоцитах крови существенно превышает контрольные значения [13, 14]. Доказано также, что высокие значения показателя доли аберрантных метафаз, а также частоты хроматидных разрывов у шахтеров имеют значимую ассоциацию с увеличением риска развития рака [15].

В отличие от экспозиции радоном в условиях производства, данные об эффектах воздействия этого радиоактивного газа на частоту хромосомных аберраций у жителей противоречивы. Возможными причинами этому является относительно низкая концентрация радона в жилищах и (или) ограниченное число обследованных индивидов [16]. В работе шведских исследователей было показано, что повышение уровня содержания радона в воздухе (>200 Бк/м3) ассоциировано с увеличением уровня повреждений ДНК в лимфоцитах (р<0,05). В то же время никакой корреляции между содержанием радона в питьевой воде и уровнем генетических повреждений выявлено не было [17].

В ряде работ для оценки возможности индукции стабильных обменов хромосомного типа в выборках жителей домов с разной концентрацией радона была использована технология флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) [16, 18, 19]. Практически ни в одной из цитируемых публикаций не приводятся сведения о значимом увеличении частоты транслокаций в выборках лиц проживающих в условиях даже очень высоких концентраций радона в воздухе. Вместе с тем, отмечено, что частота нестабильных хромосомных обменов (дицентрических и кольцевых хромосом) достоверно увеличена в выборке жителей зданий, где концентрация радона была >200 Бк/м³ по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля (2,45±0,50 x 10^-3 и 1,03±0,15 x 10^-3; p<0,05) [16].

Эффективность использования рутинных цитогенетических тестов при оценке кластогенных эффектов воздействия сверхнормативных концентраций радона в воздухе помещений продемонстрирована исследователями из Словении [20]. Цитогенетическое обследование 85 учащихся (37 девочек и 48 мальчиков в возрасте 9-12 лет) методами оценки хромосомных аберраций и микроядер в культурах лимфоцитов крови показало статистически значимое увеличение клеток с повреждениями в опытной группе по сравнению с контролем. Доля метафаз с аберрациями в выборке детей из Словении, подверженных воздействию высоких радона (2,03%) [20], оказалась более чем в два раза ниже аналогичных показателя для детей из Горной Шории (4,74% в 2005 г., см. табл. 2). Можно предположить, что для формирования кластогенных эффектов важным является не только повышенное содержание радона в воздухе, но и фактор длительности его воздействия. С этих позиций постоянное проживание и обучение в помещениях интерната, обеспечивает длительный контакт с радоновым излучением.

Выводы:

• 1.    Обследованные дети, подвержены влиянию стабильно действующих факторов токсико-генетического риска.

• 2.    Возрастные, половые особенности обследованных, а также химическое загрязнение почв не вызывают значительной модификации частоты цитогенетических показателей. Кроме того, в исследованные группы не включены лица с хроническими патологиями, также вакцинированные и страдающие вирусными инфекциями люди. Это свидетельствует в пользу предположения о ведущей роли радона в увеличении частоты хромосомных аберраций у обследованного контингента.

Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-96031-р_урал_а; государственным контрактом Миннауки № 02.512.11.2233.