Цитогенетический анализ культуры клеток линии NGUK-1

Введение. Существуют методы цитогенетических исследований, которые позволяют контролировать генетическое постоянство клеток по набору и характеристике хромосом. Известно, что такие факторы культивирования, как нестандартность питательных сред и сывороток, вирусы и микоплазмы, могут явиться причиной дестабилизации различных клеточных характеристик, в том числе и кариологических. На сегодняшний день в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» одной из наиболее часто используемых и востребуемых клеточных культур в работе является перевиваемая линия клеток NGUK-1. В криобанке ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» хранятся образцы данной линии разных годов заморозки, начиная с 1990 года.

Хромосомный набор клеток или клеточных гибридов служит важным критерием для прослеживания природы культивируемых клеток. С помощью этого критерия можно обнаружить хромосомную локализацию того или иного генетического маркера. При росте in vitro клетки часто изменяют свой хромосомный набор, и большинство клеточных линий утрачивают характерный диплоидный набор хромосом. Клетки становятся анеуплоидными и характеризуются широким диапазоном числа хромосом в расчете на клетку.

Целью исследований являлось определение кариотипа перевиваемой линии клеток NGUK-1 (невриномы Гассерова узла крысы), культивируемой на среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крови бычков, для дальнейшей паспортизации культуры, а также индексов пролиферации этой культуры при малой плотности посева на питательной среде с 10% сывороток крови плодов коров, бычков, кур.

Материалы и методы. Клеточная линия NGUK-1 (Источник получения: крыса, невринома Гассерова узла) (Авцын А.П. и др., 1985; Авцын А.П. и др., 1989), получена в Научно – исследовательском институте морфологии человека АМН СССР. Материалом для культивирования послужила опухоль Гассерова узла тройничного нерва крысы, индуцированная переоральным введением этилнитрозомочевины. Опухоль для культивирования взята после 3-й внутримозговой трансплантации. Клетки росли в среде следующего состава: среда Игла с глутамином (80 %), сыворотка крови плодов коров (15%), куриный эмбриональный экстракт (5%) и мономицин (100 ед/мл). Посевная доза – 100 тыс. клеток/мл, кратность пересева – 1:3. Метод снятия – 0,02% версен (2/3) и 0,25% трипсин (1/3). Частота пассирования – через 3 – 5 суток. При низкой плотности клетки имеют астроцитоподобный вид, а при высокой – эпителиоподобный. NGUK-1 используется для экспресс – диагностики бешенства, определения глиотоксичности сыворотки неврологических больных и титрования интерферона.

Нами для поддержания маточных культур клеток NGUK-1 использована питательная среда следующего состава: среда Игла МЕМ с глутамином (90%), сыворотка крови плодов коров (10%), а в опытах, кроме того в качестве биологической добавки сыворотка крови бычков и кур.

При подсчете индексов пролиферации посевную концентрацию клеток NGUK-1 доводили до 84000 клеток/мл. Клеточную взвесь рассеивали по 2,5 мл в пробирки Лейтена с посевной площадью 6 см2. Плотность посева составляла 35000 клеток/см2. Клетки выращивали в термостате при температуре 370С и подсчитывали через 96 часов после посева.

Для приготовления препаратов хромосом была взята суточная культура клеток, которую инкубировали в стандартных условиях (Адамс Р., 1983). Клетки выращивали на среде Игла МЕМ с глутамином (90%), содержащий сыворотку крови бычью (10%) и антибиотики (пенициллин, стрептомицин и канамицин) по 100 ед/мл. Приготовление препаратов осуществлялось по методу Мурхеда (1960). Контроль на стерильность проводили путем высева клеточной суспензии на МПА, МПБ, среды Сабуро, Чапека, Китта-Тарроци, ТПС-агар и ТПС-бульон.

Подсчет числа хромосом в пластинках проводили под иммерсией с помощью микроскопа АУ-12. В ходе работы было подсчитано 100 метафазных пластинок.

Кариологический анализ NGUK-1 проводили на первом пассаже после криоконсервации. Для определения модального класса и степени изменчивости клеток по числу хромосом анализировали 100 метафазных пластинок окрашенных красителем Гимза.

Результаты проведенных исследований показали, что клеточная линия NGUK-1 отличается высокой пролиферативной активностью. Индексы пролиферации ее после 96 часового роста при плотности посева 35000 клеток/см² с разными сыворотками крови животных приведены в табл.1.

1. Индексы пролиферации культуры клеток NGUK-1 на среде Игла МЕМ с разными сыворотками крови животных

Сыворотка крови животных	№ опыта	Индекс пролиферации через 96 часов после посева клеток
Плодов коров	1 2	6,35±0,20 5,91±0,17
Бычья	1 2	4,97±0,19 4,84±0,13
Кур	1 2	7,73±0,18 7,48±0,21

Из таблицы следует, что лучшей биологической активностью, даже при такой низкой плотности посева клеток NGUK-1,обладает сыворотка крови кур, хотя сыворотки крови плодов коров и бычков так же обеспечивали их хороший рост.

При плотности посева 35000 клеток/см2 культура NGUK-1 образовывала монослой через 72-96 часов роста.

Кариологический анализ показал, что модальный класс хромосом культуры клеток NGUK-1 составляет 37-42, а пределы изменчивости по числу хромосом 27 – 85.

Кроме того, установлено, что продолжительность хранения клеток в жидком азоте не оказывает влияния на их морфологию, что показано на рис.1.

1. Культура клеток NGUK-1 через 19 часов культивирования при 370 С и кратности деления 1:3.

Заключение. Проведенными исследованиями установлено, что длительность хранения клеток NGUK-1 в жидком азоте не оказывает негативного влияния на их пролиферативную активность, морфологию, кариологию и чувствительность к вирусам.

Разработан лабораторный регламент №4 по использованию культуры клеток NGUK-1 для репродукции вируса болезни Ауески с научноисследовательской целью. Результатами проведенных исследований по хромосомному набору подтверждено соответствие культуры NGUK-1 данной линии клеток.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Авцын, А.П. Новая клеточная линия невриномы Гассерова узла крысы NGUK-1/ А.П. Авцын, Л.И. Кондакова, А.С. Халанский и др.// Цитология. – 1989. – Т.31. - №1. – С.97-102. 2. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков/ Р. Адамс. - М.: Мир. – 1983. – С.264. 3. Плотникова, Э.М. Цитогенетический анализ культуры клеток линии MDBK/ Э.М. Плотникова, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, Р.Х. Хусаенов// Сборник материалов. Научная программа. Тезисы. VII Межд. конф. «Молекулярная медицина и биобезопасность». – М. – 2010. – С. 146147.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЛИНИИ NGUK-1

Хусаенов Р.Х. Резюме

Результатами проведенных исследований по хромосомному набору подтверждено соответствие культуры NGUK-1 данной линии клеток.

CYTOGENETIC THE ANALYSIS CULTURES OF CELLS OF LINE NGUK-1

Khysaenov R.K. Summary

Results of the lead researches on a chromosomal complement confirm conformity of culture NGUK-1 of the given line of cells.