Цитогенетический статус кобыл (Equus caballus) украинской верховой породы в связи с оплодотворяемостью

Генетическая оценка Equus caballus проводится во многих странах (1-3). Несмотря на это, в доступной литературе нам не удалось найти публикаций о влиянии цитогенетического статуса кобыл на результативность искусственного осеменения замороженной и оттаянной спермой. В странах с развитым коневодством цитогенетические исследования кобыл применяются на практике гораздо шире, чем в Украине, а в случаях эмбриональной смертности — в обязательном порядке (4-6). Известно, что в коневодстве Украины интенсивная селекция без достаточно широких фундаментальных цитогенетических исследований могла привести к распространению цитогенетических аномалий, которые способны снижать репродуктивную функцию (7-9). Возможно, именно поэтому выход жеребят в целом по отрасли коневодства Украины не превышает 50 %, а для большинства разводимых пород не обеспечен необходимый минимум племенного воспроизводительного поголовья. Из 12 официально зарегистрированных в Украине пород E . caballus только 3 имеют достаточное количество племенных животных; при этом общая численность поголовья лошадей на начало 2015 года сократилась до 320-330 тыс. (10). Поэтому фундаментальной задачей становится сохранение и увеличение численности поголовья, что отражено в программе развития коневодства в Украине до 2020 года. Определенная роль в этом отводится применению современных методов биотехнологии репродукции (11, 12), однако они неэффективны, 302

если у кобыл диагностируется ановуляторный половой цикл, вызванный гипофункцией яичников либо цитогенетическими нарушениями.

Отметим, что в последние годы у всех видов животных (как и у человека) отмечают снижение репродуктивной функции, рост числа акушерско-гинекологических заболеваний, что, возможно, отчасти связано с ухудшением экологической ситуации (13-16). В условиях зоопарков все шире применяют цитогенетические исследования с целью сохранения полноценного генофонда и эффективной репродукции животных (17-18).

Эти факты указывают на необходимость применения цитогенетических исследований для выявления причин ановуляторных половых циклов и повышения оплодотворяемости кобыл как при естественной случке, так и после искусственного осеменения. В первую очередь цитогенетическому обследованию следует подвергать кобыл с ректально подтвержденной гипофункцией яичников как наиболее распространенной патологией. Однако в Украине проводили лишь несколько цитогенетических исследований E . caballus в связи с репродуктивной функцией, но без изучения связи с результативностью искусственного осеменения (19, 20).

В настоящей работе мы впервые показали, что оплодотворяемость кобыл украинской верховой породы зависит от степени нестабильности их хромосомного аппарата (при отсутствии геномных мутаций и сбалансированных цитогенетических нарушений, передаваемых потомству), причем этот эффект проявляется сильнее, если конематок осеменяют не охлажденной, а деконсервированной спермой.

Целью исследования было установление влияния цитогенетического статуса самок Equus caballus на полноценность их полового цикла и результативность оплодотворяемости по харьковской технологии.

Методика. В одних и тех же хозяйствах (частные конные заводы и племрепродукторы в Харьковской, Полтавской, Днепропетровской, Запорожской и Киевской областях Украины) на протяжении 3 лет (2012-2015 годы) проводили обследование 143 кобыл украинской верховой породы.

Кровь для цитогенетических исследований отбирали до осеменения один раз в неделю общепринятыми методами из яр¸мной вены с соблюдением правил асептики и антисептики в стерильные пробирки с гепарином. В стерильных условиях лимфоциты культивировали в среде Игла или среде 199 («Sigma», США) с добавлением инактивированной сыворотки теленка, фитогемагглютинина («Sigma», США) и антибиотиков (пенициллин или стрептомицин, 100 мг/см³) при 37 ° С на протяжении 48-56 ч, после чего готовили препараты метафазных пластинок лимфоцитов (21, 22). Препараты просматривали в световом микроскопе Jenaval («Carl Zeiss», Германия) под масляной иммерсией при увеличении ½1000.

На основании цитогенетических данных до начала случного сезона и осеменения кобыл разделили на группы в зависимости от процента метафаз с аберрациями (до 5 %, 5-10 % и более 10 %). После этого провели комплекс зоотехнических и ветеринарных мероприятий для усиления репродуктивной функции (улучшение кормления и содержания, увеличение длительности моциона, применение разработанного комплекса лечебных мер) у кобыл с установленной гипофункцией яичников. Животных с геномными мутациями и сбалансированными цитогенетическими аномалиями, передающимися по наследству, из исследования исключали.

Оптимальное время осеменения диагностировали комплексно с применением ультразвукового сканера Aquila Pro («Esaote», Spain) для ветеринарии с ректальным линейным зондом (частота 6-8 МГц).

Искусственное осеменение проводили при первом полноценном овуляторном половом цикле по харьковской технологии (10) с помощью разработанного нами инструмента (23). Использовали охлажденную и де-консервированную сперму. Охлажденная сперма жеребцов перед осеменением хранилась в бытовом холодильнике при температуре 2-4 °С не более 48 ч. Сперму замораживали по харьковской технологии (10), спермодозы были расфасованы в шприц-тюбы объемом 5 см3 с концентрацией сперми-ев 150-200 млн/см3. На одно осеменение использовали одну спермодозу. Размораживали спермодозы (шприц-тюбы) в водяной бане при температуре 38-40 °С в течении 2-3 мин. После размораживания для осеменения использовали только те спермодозы, в которых подвижность спермиев была не ниже 3 баллов (не менее 30 % спермиев с прямолинейно-поступательным движением). Жеребцы-доноры имели допустимую хромосомную изменчивость (менее 5 % метафаз с аберрациями), геномные мутации и наследуемые сбалансированные цитогенетические нарушения отсутствовали.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами (24), а также с применением специализированной программы SPSS («IBM», США). В таблицах приведены средние ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM). Различия оценивали по t -критерию Стьюдента и считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты. При сохранении украинского генофонда E . caballus первоочередная проблема заключается в снижении числа кобыл с ановуля-торными половыми циклами, так как у таких животных оплодотворение становится невозможным (25). При комплексной диагностике состояния репродуктивной сферы отклонения от физиологической нормы отмечали у животных с хромосомной изменчивостью, превышающей 5 %. На рисунке 1 представлен физиологический предовуляторный фолликул кобылы при допустимом числе метафаз с аберрациями и гипофункциональный яичник особи, у которой их процент повышен.

Рис. 1. Физиологический фолликул кобылы ( Equus caballus ) украинской верховой породы с допустимым цитогенетическим статусом (слева) и гипофунк-циональный яичник при повышенном проценте метафаз с аберрациями (справа) .

Рис. 2. Метафазные пластинки кобыл ( Equus caballus ) украинской верховой породы без аберраций (слева) и с повышенной хромосомной нестабильностью (справа) : 1 — парные фрагменты, 2 — кольцевые образования, 3 — дицентри-ческие хромосомы.

Вид нормальной метафазной пластинки и пример наблюдаемых цитогенетических нарушений иллюстрирует рисунок 2.

Как следует из данных, представленных в таблицы 1, кобылы с показателем общей хромосомной нестабильности до 5 % и физиологическим половым циклом имели на 5,31 % меньше (р < 0,001) метафаз с аберрациями, чем животные из группы с 5-10 % аберраций, и на 17,09 % меньше (р < 0,001) метафаз с аберрациями по сравнению с конематками, у которых регистрировали более 10 % аберрантных метафаз.

1. Цитогенетический статус кобыл ( Equus caballus ) украинской верховой породы и их оплодотворяемость при искусственном осеменении по харьковской технологии ( M ±SEM, частные конные заводы и племрепродукторы Украины, 2012-2015 годы)

Показатель	Метафазы с аберрациями
	до 5 %	5-10 %	более 10 %
Число исследованных метафаз	2418	2486	2930
Число кобыл в группе	44	45	54
Метафаз с аберрациями	1,48±0,08	4,40±0,11***	10,67±0,22***
Относительное число метафаз с аберрациями, %	2,70±0,14	8,01±0,22***	19,79±0,46***
Родилось жеребят от охлажденной спермы, %	92,00±1,15	90,00±1,11	60,19±0,93**
Родилось жеребят от оттаянной спермы, %	71,60±1,14	56,67±1,11*	37,04±1,85**
*, **, *** Различия статистически значимы в сравнении с первой группой кобыл (до 5 % рациями) соответственно при р < 0,05; р < 0,01 и р < 0,001.			метафаз с абер-

При применении деконсервированной спермы влияние цитогенетического статуса самок на оплодотворяемость при осеменении прослеживалось более четко, чем в случае охлажденной, что согласуется с результатами применения замороженно-оттаянной спермы жеребцов другими исследователями (26, 27). Осеменение проводили при первом полноценном овуляторном половом цикле. Оплодотворяемость от применения охлажденной спермы (по проценту рожденных жеребят) у кобыл с цитогенетическим статусом более 10 % метафаз с аберрациями была наименьшей: в среднем на 29,81 и 31,86 % ниже (р < 0,01), чем у животных из групп соответственно с 5-10 % и < 5 % метафаз с аберрациями. При осеменении охлажденной спермой у конематок из первой (до 5 % метафаз с аберрациями) и второй (5-10 % метафаз с аберрациями) групп оплодотворяемость не имела достоверных различий.

Оплодотворяемость оттаянной спермой была наибольшей в группе с общей хромосомной нестабильностью < 5 %, в среднем превысив на 14,93 % (р < 0,05) показатель у кобыл из второй группы и на 34,56 % (р < 0,01) — у особей с наибольшим процентом метафаз с аберрациями (> 10 %). Другие исследователи тоже отмечают, что цитогенетический статус кобыл особенно важен при использовании деконсервированной спермы (28, 29).

2. Структура хромосомных аберраций у кобыл ( Equus caballus ) украинской верховой породы с разной степенью хромосомной нестабильности ( M ±SEM, частные конные заводы и племрепродукторы Украины, 2012-2015 годы)

Показатель	Метафазы с аберрациями
	до 5 %	1        5-10 %         1	более 10 %
Всего аберраций Структура аберраций, %:	1,95±0,10	6,69 ±0,27***	14,41±0,33***
единичные фрагменты хромосом	70,08±3,78	47,57±2,10***	43,02±1,85***
парные фрагменты хромосом	23,11±5,10	27,75±1,65	23,11±0,77
кольцевые хромосомы	0,00±0,00	10,36±1,70	16,84±1,20**
пробелы и разрывы хромосом	6,81±5,29	13,74±1,95	16,27±1,03
дицентрические хромосомы	0,00±0,00	0,58±0,66	0,76±0,87

*, **, *** Различия статистически значимы в сравнении с первой группой кобыл (до 5 % метафаз с аберрациями) соответственно при р <  0,05; р <  0,01 и р <  0,001.

Изучение структуры хромосомных аберраций (табл. 2) показало, что их общее число у кобыл из первой группы (с допустимой общей хромосомной нестабильностью) было в среднем на 4,74 меньше (р < 0,001), чем во второй группе, и на 12,46 меньше (р < 0,001), чем в третьей. Среди аберраций преобладали единичные фрагменты хромосом, причем в первой группе этот показатель был на 22,51 % выше (р < 0,001), чем во второй, и на 27,06 % выше (р < 0,001), чем в третьей, где число ановуляторных циклов наибольшее. Процент парных фрагментов хромосом был в среднем практически одинаков у самок с общей хромосомной нестабильностью до 5 % и более 10 %, а во второй группы этот показатель недостоверно превышал таковой в первой и третьей группах на 4,64 %. У животных с из первой группы кольцевых хромосом не наблюдали, а в третьей группе их было на 6,48 % больше (р < 0,01), чем во второй. Число пробелов и разрывов в обследованных метафазных пластинках было наименьшим у кобыл из первой группы, что в среднем на 6,93 % меньше, чем во второй, и на 9,46 % меньше, чем в третьей. У обследованных кобыл с допустимым уровнем хромосомной нестабильности (до 5 %) дицентрических хромосом не обнаружили, их наибольший процент был установлен у животных из третьей группы, имеющих более 10 % метафаз с аберрациями, что оказалось на 0,18 % больше, чем во второй группе с общей хромосомной нестабильностью 5-10 %.

Таким образом, впервые в Украине изучено влияние цитогенетического статуса конематок Equus caballus украинской верховой породы на полноценность их полового цикла и оплодотворяемость по харьковской технологии. Установлено, что для повышения оплодотворяемости кобыл целесообразно разделять их в зависимости от цитогенетического статуса (с числом метафаз с аберрациями до 5 %, 5-10 % и более 10 %). Такое разделение позволяет повысить оплодотворяемость как при естественной случке, так и при искусственном осеменении. При этом оплодотворяемость декон-сервированной спермой у кобыл с числом аберрантных метафаз до 5 % составила в среднем 71,60 %, с 5-10 % таких метафаз — 56,67 %, более 10 % — только 37,04 %. Следовательно, особенно важно учитывать цитогенетический статус кобыл при использовании деконсервированной спермы.