Цитотоксический и прооксидантный эффекты аскорбата лития in vitro

Литиевые соли, внедренные в психиатрию в середине прошлого века, до сих пор широко используются в качестве нормотимиков – стабилизаторов настроения [1]. Наиболее распространенным препаратом остается карбонат лития.

Механизм действия лития весьма сложен и продолжает активно изучаться. Достоверно показано, что литий включается в целый ряд механизмов внутриклеточной регуляции. Ключевой мишенью лития является ингибирование киназы гликогенсин-тазы 3 (GSK-3)[2]. Вместе с тем литий обладает ан-тиапоптотическим действием и, вероятно, влияет на Akt1/PI3K/mTOR путь [3]. Помимо этого литий обладает выраженной нейропротективной активностью in vivo [4].

В последнее время появились публикации о комплексном защитном действии ионов лития при индуцированном окислительном стрессе [5, 6]. Развитие окислительного стресса отмечается при ряде соматических и психических патологий, в частности показано истощение антиоксидантных систем при алкоголизме [7, 8]. Поэтому применение антиоксидантов в комплексной терапии патогенетически обосновано.

В настоящее время ведется разработка и изучение новых комплексных препаратов лития с антиоксидантными свойствами [9]. Показано, что среди изученных соединений выраженной антиоксидантной активностью обладает аскорбат лития, который в то же время характеризуется нейропротекторными свойствами [10] и способен защищать белки и липиды плазмы крови от повреждающего действия этанола [11].

В этой связи важной задачей является оценка биологической активности соединений лития, в частности их влияние на окислительный стресс и цитотоксичность в клеточных культурах. В данной работе впервые проведена оценка цитотоксического действия аскорбата лития и изучен его эффект на продукцию активных форм кислорода в культуре мононуклеаров периферической крови человека.

Цель исследования – изучение цитотоксического и прооксидантного эффектов аскорбата лития in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы

Необходимое для эксперимента количество аскорбата лития синтезировано на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета. Синтез произведен из химически чистых реагентов карбоната лития и аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Германия). Аскорбат лития перекристаллизовывали и использовали в дальнейших опытах.

Получение клеточной культуры мононуклеаров крови человека

В исследовании использовали кровь 9 здоровых лиц – 3 мужчин и 6 женщин в возрасте от 25 до 54 лет, медиана – 35,0 (25,0–53,0). Кровь получена из локтевой вены в пробирки с гепарином натрия системы однократного применения Vacutainer («Bec-ton Dickinson», США). Мононуклеары выделяли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности фиколла (ρ=1,077 г/см3) («Sigma-Aldrich», США) по стандартной методике [9]. Полученные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640. Клеточную суспензию сразу использовали в экспери- менте.

Изучение цитотоксической активности

Исследование окислительного стресса

Влияние соединений на окислительный стресс исследовали с использованием набора реагентов «Oxidativestress» (MerckMillipore, Германия) на проточном цитолюориметре «MuseCellAnalyzer» (MerckMillipore, Германия). Левый пик графика (гейт M1) считали как процент клеток, свободных от активных форм кислорода, и обозначали как ROS(-), правый пик графика (гейт M2) считали как процент клеток, содержащих активные формы кислорода, – ROS(+).

С целью оценки цитотоксической активности и окислительного стресса мононуклеары инкубировали в присутствии аскорбата лития или аскорбата в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. В исследовании использованы следующие концентрации: 0,5, 1 или 2 ммоль/л конечной концентрации ионов лития в лунке.

Статистическая обработка результатов п роведена с помощью программы SPSS (версия 20.0). Рассчитывали медиану, первый и третий квартили.

Для сравнения количественных переменных использовались критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Была проведена оценка цитотоксического действия аскорбата лития. Данные о проценте клеток в состоянии апоптоза и некроза представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Таблица 1

Уровень клеточной гибели (%) при воздействии аскор бата лития - Me (Q 1 - Q₃) (критерий Манна-Уитни)

Показатель	Группа
	Ранний апоптоз (early apoptosis)	Поздний апоптоз/некроз (late apoptosis/dead)	Некроз (dead)
Интактные клетки	13,30 (10,20–13,45)	12,88 (10,20–13,45)	0
0,5 ммоль/л	31,941	61,734	0,08
аскорбата лития	(30,55–35,24)	(52,85–67,36)	(0–0,2)
1 ммоль/л	28,02	64,935	0,05
аскорбата лития	(27,10–34,29)	(52,98–72,07)	(0–4,0)
2 ммоль/л	28,803	69,306	0,05
аскорбата лития	(25,50–34,64)	(50,77–72,22)	(0–0,9)

П р и м е ч а н и е. 1, 4, 5 – р<0,001 по сравнению с интактными клетками; 2 – p=0,004 по сравнению с интактными клетками; 3 – p=0,001 по сравнению с интактными клетками; 6 – p=0,006 по сравнению с интактными клетками.

Был обнаружен цитотоксический эффект аскорбата лития, заключающийся в статистически значимом (р<0,05) повышении процента клеток в состоянии раннего апоптоза и позднего апоптоза/некроза при инкубации с данным соединением. Дозозависимого эффекта аскорбата лития на вышеперечисленные параметры не найдено (р>0,05).

APOPTOSIS PROFILE

Late Apop./Dead

2.38%

а

APOPTOSIS PROFILE

7.46 %

Early Apop.

V Apoptotic

V Apoptotic

б

LateApop./Dead

54.90 %

31.55% Early Apop.

4-

Live ANNEXIN V Apoptotic

Рисунок 1. Цитотоксичность аскорбата лития и аскорбиновой кислоты в эксперименте: (а) интактная культура, (б) культура в присутствии 2,0 ммоль/л аскорбата лития, (в) культура в присутствии 2,0 ммоль/л аскорбиновой кислоты

По результатам эксперимента нами была выдвинута гипотеза и том, что цитотоксический эффект аскорбата лития может реализоваться через действие аскорбат-аниона. Для подтверждения данной гипотезы проведена оценка цитотоксичности аскорбиновой кислоты (табл. 2 и рис. 1).

Как видно из таблицы 2 и рисунка 1, аскорбиновая кислота обладала выраженным цитотоксическим действием, проявляющимся в статистически значимом (р<0,05) повышении процента клеток в состоянии апоптоза и некроза. Не было обнаружено дозо- зависимого цитотоксического эффекта данного соединения (р>0,05).

Таблица 2

Уровень клеточной гибели (%) при воздействии аскор бата лития - Me (Q 1 - Q₃) (критерий Манна-Уитни)

Показатель	Группа
	Ранний апоптоз (early apoptosis)	Поздний апоптоз/некроз (late apoptosis/dead)	Некроз (dead)
Интактные клетки	13,30 (10,20–13,45)	12,88 (10,20–13,45)	0
0,5 ммоль/л аскорбиновой кислоты	30,551 (26,35–37,58)	60,274 (56,20–63,04)	0,10 (0–5,51)
1 ммоль/л аскорбиновой кислоты	34,902 (16,32–38,44)	54,975 (47,28–61,60)	1,71 (0–7,71)
2 ммоль/л аскорбиновой кислоты	29,393 (26,11–40,30)	62,606 (50,25–70,50)	0

П р и м е ч а н и е. 1, 4, 5, 6 – р<0,001 по сравнению с интактными клетками; 2, 3 – p=0,001 по сравнению с интактными клетками.

Известно, что аскорбиновая кислота способна выступать как в качестве восстановителя (антиоксидант), так и качестве окислителя (прооксидант). Нами было выдвинуто предположение, что цитотоксический эффект аскорбат-аниона может быть опо- средован индукцией окислительного стресса. Произведена оценка содержания активных форм кислорода в мононуклеарах периферической крови при действии аскорбата лития и аскорбиновой кислоты. Данные представлены в таблице 3 и на рисунке 2.

Таблица 3

Содержание клеток с активными формами кислорода (%) при воздействии аскорбата лития и аскорбиновой кислоты - Ме (Q1 - Q3) (критерий Манна-Уитни).

Показатель	Клетки с активными формами кислорода, (%)
Интактные клетки	13,0 (6,45–23,68)
0,5 ммоль/л аскорбата лития	83,101 (80,88–90,46)
1 ммоль/л аскорбата лития	83,322 (80,22–89,13)
2 ммоль/л аскорбата лития	90,583 (81,55–91,41)
0,5 ммоль/л аскорбиновой кислоты	84,574 (71,74–90,23)
1 ммоль/л аскорбиновой кислоты	85,935 (82,44–88,89)
2 ммоль/л аскорбиновой кислоты	87,196 (84,81–88,87)

П р и м е ч а н и е. 1, 2, 3, 4, 5, 6 – р<0,001 по сравнению с интактными клетками.

а                                         б                                        В

Рисунок 2 . Содержание активных форм кислорода (ROS) в интактных мононуклеарах периферической крови (а) и при действии аскорбата лития (б) и аскорбиновой кислоты (в) Гейт M1 – ROS-негативные клетки, гейт М2 – ROS-позитивные клетки.

Как видно из таблицы 3 и рисунка 2, как аскорбат лития, так и аскорбиновая кислота обладала выраженным прооксидантным действием, статистически значимо (р<0,001) повышая содержания клеток с активными формами кислорода. Дозозависимого эффекта данных соединений в отношении продукции активных форм кислорода не было обнаружено (р>0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, в нашем исследовании обнаружена выраженная цитотоксичность аскорбата лития, реализуемая прооксидантным действием аскорбат-аниона. Исследование уровня окислительного стресса в культуре клеток полностью коррелирует с уровнем цитотоксичости в культуре, что подтверждает окислительный пусковой механизм данного процесса. Аналогичные результаты получены для аскорбиновой кислоты в тех же дозах, что подтверждает основное действие аскорбат-аниона, однако действие иона лития в данном случае не вносит существенного вклада в цитотоксический эффект, наблюдаемый в культуре мононуклеаров периферической крови.

Традиционно считается, что аскорбиновая кислота и аскорбат-анион являются антиоксидантами, обладая выраженными восстановительными свойствами, метаболизируясь до дегидроаскорбиновой кислоты [10] (рис 3).

но—с

ЛскорБиноВая кислова

Р и с у н о к 3 . Окисление аскорбиновой кислоты

НО—С О

но— с —н

стресса при действии аскорбата аниона. В ряде исследований доказано, что аскорбиновая кислота может запускать окислительный стресс. Продемонстрировано, что этот процесс катализируется ионами металлов: железо (III) [11], медь (II) [12] (рис. 4), кадмий (II) и никель (II) [13]. Результатом этого процесса является образование гидроперекиси водорода. В здоровых клетках организма экспрессия антиоксидантных ферментов достаточна, чтобы нейтрализовать перекись водорода и предотвратить индукцию окислительного стресса.

Нами было показана индукция окислительного

Ascorbate + Си2+ + О2 + 2Н+ —»Dehydroascorbate 4- Си+ + Н2О2

Си+ + Н2О2 — Си2+ + ОН’ + ОН*

Рисунок 4 . Окисление аскорбиновой кислоты в присутствием ионов меди (II) с образованием гидроперекиси водорода

N.H. Riordan et al. (1995) предположили, что аскорбиновая кислота в дозах, превышающих физиологические, может быть использована как препарат химиотерапии ввиду того, что в опухолевых клетках понижена экспрессия антиоксидантных ферментов [14]. Вследствие этого перекись, образованная окислением аскорбиновой кислоты, слабо утилизируется, приводя к индукции окислительного стресса и цитотоксичности аскорбат-аниона.

Аскорбат лития, являясь солью аскорбиновой кислоты, сохраняет присущие ей антиоксидантные свойства. Ранее была установлена высокая активность аскорбата лития в отношении кислородных радикалов [15]. Однако это исследование было выполнено на плазме крови. Так же, как было сказано выше, аскорбат лития обладает нейропротекторным свойствами in vivo [8]. Вероятно, что в изолированной культуре мононуклеаров, культивируемых в среде RPMI-1640, предназначенной для работы с лимфоидными клетками, не достигается достаточный уровень экспрессии антиоксидантных ферментов, способных утилизировать гидроперекись водорода и, как следствие, нивелировать прооксидант-ные свойства аскорбат-аниона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлен цитотоксический эффект аскорбата лития в отношении мононуклеаров периферической крови. Данный эффект объясняется проокислитель-ным действием аскорбат-аниона. Цитотоксического и прооксидантного эффектов ионов лития не выявлено. Для оценки аскорбата лития как потенциального фармакологического препарата требуются дальнейшие исследования как на других клеточных культурах in vitro, так и в экспериментах in vivo.