Детекция генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина, у актинобактерий, выделенных из почвы района разработки Верхнекамского соленосного бассейна

Промышленная разработка Верхнекамского соленосного бассейна (ВСБ) сопровождается изменением природного ландшафта и физико-химических характеристик почвы, в частности, засолением [Ба-бошко, Бачурин, 2009]. Из литературных источников известно, что увеличение солености среды приводит к сукцессии микробоценоза с преоблада- нием в нем галотолерантных и галофильных микроорганизмов [Boujelben et al., 2012; Bolhuis et al., 2013; Qiu et al., 2013; Luo et al., 2016; Gonzalez-Silva et al., 2017; Ou et al., 2018].

Ранее из почв территории солеразработки ВСБ были выделены бактерии класса Actinobacteria, принадлежащие родам Rhodococcus, Microbacte-

rium и Brevibacterium [Плотникова и др., 2001, 2006; Гавриш и др., 2004; Anan'ina et al., 2011]. Представителей перечисленных таксономических групп часто обнаруживают в различных засоленных экосистемах, таких как морские осадки, почвы мангровых лесов, нефтяные рассолы и нефтезагрязненная почва [Megaw et al., 2013; Lee et al., 2014; Yuan et al., 2014; Claverías et al., 2015], что может указывать на то, что бактерии этих таксономических групп обладают эффективными генетико-биохимическими механизмами осмоадаптации, сведения о которых ограничены [Nagata et al., 1998; Alvarez et al. 2014]. В связи с этим представляется актуальным исследование генетических детерминант синтеза низкомолекулярных соединений – осмопротекторов актинобактерий.

Цель данной работы – исследование генов биосинтеза эктоина у бактерий класса Actinobacteria , выделенных из района солеразработок ВСБ.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Объектами исследования были штаммы бактерий Rhodococcus spp. SMB37, B1-4. B2-1, SMB38, B13 и B14 [Anan’ina et al., 2011], Microbacterium spp. SMB33 и Y6, Brevibacterium sp. B-R, выделенные ранее из почв района солеразработок ВСБ методом накопительного культивирования в среде Раймонда с нафталином в присутствии 60 г/л NaCl.

Среды и условия культивирования

Минеральная среда Раймонда (г/л деионизированной воды): NH 4 NO 3 – 2.0, MgSO 4 x7H 2 O – 0.2, KH 2 PO 4 – 2.0, Na 2 HPO 4 – 3, CaCl 2 x6H 2 O – 0.01, Na 2 CO 3 – 0.1, pH – 7.0 [Raymond, 1961].

Агаризованная богатая среда Раймонда следующего состава (г/л среды Раймонда): триптон – 5, дрожжевой экстракт – 2.5, NaCl – 30, агар – 15.

Культивирование бактерий проводили на ага-ризованной богатой среде Раймонда в термостатируемом шкафу ТС-1/80 СПУ (Россия) при температуре 28 ° С.

Молекулярно-генетические и биоинформационные методы исследования

Геномную ДНК из бактериальных клеток выделяли SDS-CTAB методом [Wilson, 1995].

Амплификацию ect -генов на матрице ДНК исследуемых штаммов проводили на приборе С1000 Touch («Bio-Rad», США).

ПЦР выполняли в 25 мкл смеси, состоящей из 1х буфера для HotTaq -полимеразы («Силекс», Россия), 0.25 мМ дНTФ, 4 мкг БСА, 2 ед. акт. HotTaq- полимеразы («Силекс», Россия) и 20 нг геномной ДНК. Для подбора оптимального состава ПЦР смеси было проведено несколько реакций, отличающихся концентрацией MgCl 2 (0.75 мМ, 1.25мМ или

2.5 мМ). В ПЦР смеси количество праймеров G1F/G1R2017 было 12.5 пкмоль каждого, а для олигонуклеотидов G2F/G2R составило 12.5 или 100 пкмоль каждого.

Процедура ПЦР включала начальную денатурацию при 95 ° С, которая длилась 10 мин. Далее следовали 30 циклов, состоящие из последовательно повторяющихся шагов: денатурации при 94 ° С в течение 30 сек., отжига праймеров G1F/G1R 2017 при температуре 55 ° С на протяжении 30 сек., каждый цикл завершала элонгация при 72 ° С длительностью 1 мин. 20 сек. После 30-го цикла следовала терминальная элонгация при 72 ° С продолжительностью 10 мин. Для системы праймеров G2F/G2R протокол ПЦР был таким же, за исключением температуры отжига, составляющей 54 ° С.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле в 0.5х ТВЕ-буфере в напряжении электрического поля 5.0 V/см в течение 60 мин. ДНК была визуализирована после окрашивания бромистым этидием (0.5 мкг/мл) в проходящем УФ-свете и документирована системой Gel Doc XR («Bio-Rad», США) для преобразования сигналов в цифровые данные. Полученные электрофореграммы обрабатывали с помощью программы Quantity One v.3.0.

Секвенирование генов проводили с помощью разработанных праймеров, Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v3.1 («Thermo Fisher Scientific», США) на приборе Genetic Analyzer 3500xl («Thermo Fisher Scientific», США), следуя инструкциям фирмы-производителя.

Биоинформационное обеспечение. Поиск генетических локусов, кодирующих ферменты синтеза эктоина, осуществляли в геномах галотоле-рантных актинобактерий, депонированных в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) . Пакет программ BioEdit (, позволяющий выравнивать нуклеотидные последовательности. Пакет программ Vector NTI. Подбор праймеров осуществляли, следуя рекомендациям [Патрушев, 2004; Designing …].

Результаты и их обсуждение

Конструирование праймеров

Анализ выравненных нуклеотидных последовательностей ect-оперона 46 штаммов бактерий представителей родов Rhodococcus, Brevibacterium, Microbacterium выявил две консервативные области длиной от 20 до 23 нуклеотидов: позиции 1378141—1378161 ectB-гена, позиции 1379645— 1379667 ectС-гена согласно нумерации R. jostii RHA1 (CP000431). На 3'-конце предполагаемых праймеров первые два нуклеотида были одинаковыми для всех последовательностей, а на 5'-конце были позиции, имеющие до 4 нуклеотидных замен. Нуклеотидные последовательности ectA-гена проявили высокую степень дивергенции, что не позволило обнаружить участки ДНК, соответствующие перечисленным выше параметрам.

Принимая во внимание в выбранных регионах вариабельные нуклеотидные позиции, были сконструированы следующие праймеры: G1F 5'GAYTTCTTYKCVGGIGCVGG3' и G2R 5'GGRTAIACACCDTTYTCDTYRTG3' (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика праймеров

Параметр	G1F	G1R2017	G2F	G2R
Длина, п.н.	20	20	20	23
Степень вырожденности*	72	24	48	144
Содержание ГЦ, %	61.7	50.8	55	44.2
Температура плавления, оС мин. - макс. (средняя)	56—69 (62.5)	54—65 (59.5)	54—67(60.5)	55 —65 (60)
Порядковый № нуклеотида, соответствующего 5'-концу праймера согласно нумерации R. jostii RHA1 (CP000431 ), в скобках указано название гена	1378141 ( ect B)	1378904 ( ect B)	1378891 ( ect B)	1379667 ( ect C)

Примечание. *Степень вырожденности праймера рассчитывали, перемножая количество вариантов нуклеотидов в каждой позиции.

Тестирование данной пары праймеров in silico на матрице геномной ДНК R. jostii RHA1 (CP000431) в программе Vector NTI, при установленных по умолчанию условиях, выявило разницу в содержании ГЦ-пар 17.4% и температур плавления 7.0 ° С, превышающие максимально допустимые значения 10% и 6 ° С [Кригер и др., 2012]. В связи с этим было принято решение сконструировать дополнительные олигонуклеотиды G1R2017 5'AAIGTICCRTTRTGYTCVCC3' (позиции 1378885-1378904 R. jostii RHA1 (CP000431)) и G2F5'CAYAAYGGBACITTYCGYGG3' (позиции 1378891-1378911 R. jostii RHA1 (CP000431)) (рисунок). Последующее тестирование пар праймеров G1F/G1R2017 и G2F/G2R in silico , описанным выше способом, показало следующее значение разницы ГЦ-пар: 10.8%. Разница температур плавления для пар праймеров G1F/G1R2017 и G2F/G2R составила 6.4 ° С и 3.9 ° С, соответственно. Таким образом, амплификацию исследуемого региона проводили двумя парами праймеров G1F/G1R2017 и G2F/G2R (рисунок).

G1F              G2F ectA               ectB            ectC

G1R2017                G2R

Пространственная организация ect ABC-генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина, в геномах галотолерантных актинобактерий и области гибридизации праймеров:

горизонтальными стрелками обозначены гены, вертикальными указано направление амплификации

Апробирование праймеров

Провели тестирование праймеров на ДНК матрице исследуемых штаммов в ПЦР смесях, отличающихся по концентрации MgCl2 и количеству олигонуклеотидов. Установлено, что синтез специфического продукта реакции для системы праймеров G1F/G1R2017 осуществляется при концентрации 1.25 мМ MgCl2 и 12.5 пкмоль каждого праймера. Для системы G2F/G2R эти показатели составили 2.5 мМ MgCl2 и 100 пкмоль каждого праймера (табл. 2). В то время как при количестве 12.5 пкмоль каждого праймера G2F и G2R продукт реакции не детектировался. Длина синтезированного продукта в обоих случаях составила около 800 п.н., соответствующая рассчитанной длине такового R. jostii RHA1 (CP000431).

Применение для амплификации G1F/G1R2017 и G2F/G2R пар праймеров привело к детекции генов биосинтеза эктоина на матрице ДНК бактерий представителей разных филогенетических групп рода Rhodococcus (табл. 2). Кроме того, с помощью разработанных систем праймеров удалось ампли-фицировать ect -гены у бактерии рода Brevibacterium . В то же время штаммы рода Microbacterium отличались по наличию ПЦР-продукта: специфический продукт реакции был синтезирован на матрице ДНК Microbacterium sp. Y6 (табл. 2), что может указывать на отличие генетических детерминант систем синтеза эктоина штамма Microbacterium sp. SMB33 от представленных в базе данных Национального центра биотехнологической информации США.

Для подтверждения амплификации фрагмента ect- оперона была определена нуклеотидная последовательность ПЦР-продуктов. Последующий сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы Blastn

выявил их Actinobacteria.

гомологию с    ect -генами   бактерий класса

Таблица 2

Амплификация фрагмента ect -оперона на матрице геномной ДНК исследуемых штаммов бактерий

Состав ПЦР смеси*

Штамм	Система праймеров G1F/G1R2017			Система праймеров G2F/G2R
	0.75 мМ MgCl 2 , 12.5 пкмоль каждого из праймеров	1.25 мМ MgCl 2 , 12.5 пкмоль каждого из праймеров	2.5 мМ MgCl 2 , 12.5 пкмоль каждого из праймеров	2.5 мМ MgCl 2 , 12.5 пкмоль каждого из праймеров	0.75 мМ MgCl 2 , 100 пкмоль каждого из праймеров	1.25 мМ MgCl 2 , 100 пкмоль каждого из праймеров	2.5 мМ MgCl 2 , 100 пкмоль каждого из праймеров
Филогенетически близкородственные по гену 16S рРНК виду R. artemisiae (филогенетическая группа R. rhodochrous )
SMB37	–	+	+, н.п.р.	–	–	±	+
B2-1	–	+	+, н.п.р.	–	–	±	+
B1-4	–	+	+, н.п.р.	–	–	±	+
Филогенетически близкородственный по гену 16S рРНК виду R. jostii (филогенетическая группа R.erythropolis )
SMB38	–	+	+, н.п.р.	–	– I	± I	+
Филогенетически близкородственные по гену 16S рРНК виду R. wratislaviensis (филогенетическая группа
			R.erythropolis )
B13	–	+	+, н.п.р.	–	–	±	+
B14	–	+	+, н.п.р.	–	–	+	+
Филогенетически близкородственный по гену 16S рРНК виду B. aurantiacum
B-R	–	+	+, н.п.р.	–	– I	± I	+
Филогенетически близкородственный по гену 16S рРНК виду M. esteraromaticum
Y6	–	+	+, н.п.р.	–	– I	± I	+
Филогенетически близкородственный по гену 16S рРНК виду M. oxydans
SMB33	– \	– \	–, н.п.р.	– \	– \	– \	–

Примечание. *Дополнительные компоненты смеси перечислены в гл. материалы и методы, – - целевой продукт реакции отсутствует, + - целевой продукт реакции присутствует, н.п.р. - неспецифический продукт реакции, ± - низкая концентрация целевого продукта реакции.

Таким образом, предложенную систему праймеров можно использовать для амплификации фрагмента ect -оперона у бактерий родов Rhodo-coccus, Brevibacterium и Microbacterium.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.