Диагностическое значение иммунорегуляторных медиаторов в зависимости от степени распространенности опухолевого роста при почечно-клеточном раке

В последнее десятилетие наблюдается рост заболеваемости почечно-клеточным раком (ПКР), происходящим из эпителиальных клеток почечных канальцев. В мире ПКР занимает 9 место по распространенности онкологических заболеваний [1]. Несмотря на достижения в области методов визуализации данной патологии, позволяющие выявлять до 50-60% случаев локализованного ПКР, у 25-30% больных уже при первичном обследовании, выявляют отдаленные метастазы [1, 2].

Развитие эффективных методов лечения метастатических стадий ПКР в настоящее время связывают с внедрением в клиническую практику иммунотерапии. ПКР представляет собой одну из наиболее иммуно-ин-фильтрированных опухолей с высоким уровнем инфильтрации Т-клетками, содержащую опухолетрансформированные макрофаги (ТАМ) и иммунные инфильтраты [3]. Цитокины и хемокины, экспрессируемые ТАМ, подавляют противоопухолевые иммунные механизмы и вызывают прогрессию опухолевого роста. Высокую эффективность при лечении заболевания показали комбинированные стратегии лечения, сочетающие антиангиогенную терапию и иммунотерапию основанную на подавлении иммунных контрольных точек («контрольные точки» – молекулы на определенных иммунных клетках, которые необходимо активировать (или инактивировать) для начала иммунного ответа) [4]. В последние годы установлено, что исследование содержания молекулярно-генетических биомаркеров в сыворотке крови и тканях, характеризующих активность инфильтрирующих опухоль иммунных клеток или опухолевое микроокружение (МкО), дает возможность провести оценку эффективности иммуногенных эффектов противоопухолевой терапии,а также прогнозировать развитие ее осложнений [5]. Одним из ведущих участников формирования МкО являются белки-медиаторы иммунорегуляторных процес- сов – цитокины/хемокины, колониестимулирующие и факторы роста, вырабатываемые как клетками опухоли так и ее микроокружения [6]. Перестройка цитокино-вой сети МкО связана с развитием эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), автономной цитокиновой сети, сопровождающей прогрессию опухолевого роста и активацией метастатического процесса [7]. Для оценки эффективности иммунотерапии показано прогностическое значение таких цитокинов, как TNFa (фактор некроза опухоли-альфа), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста), IL-6 (интерлейкин 6), IL-8 (интерлейкин 8) и IL-10 (интерлейкин 10) и др. [8].

В настоящее время имеются данные о следующих биомаркерах, влияющих на успех иммунотерапии рака:

• •    опухолевая мутационная нагрузка;

• •    общий иммунный статус пациента;

• •    наличие инфильтратов Т-лимфоцитов;

• •    экспрессия опухолевого PD-L1;

• •    чувствительность опухолевых клеток к уничтожению Т-клеток (включая экспрессию MHC (major histocompatibility complex), функциональный путь рецептора IFN-g);

• •    воспаление, опосредованное миелоидными клетками (высокий уровень С-реактивного белка и IL-6);

• •    высокий уровень лактатдегидрогеназы в сыворотке (что отражает как опухолевую нагрузку, так и анаэробный гликолиз) [9-11].

Диагностическое значение иммунорегуляторных медиаторов в периферической крови в качестве прогностических биомаркеров иммунотерапии у больных ПКР подтверждено лишь небольшим числом исследований [12]. Это ограничивает дальнейшее развитие эффективных стратегий лечения больных ПКР. Необходимы дополнительные исследования по поиску молекулярных маркеров при ПКР. Цель исследования – установить диагностическое значение изменений уровня медиаторов опухолевого микроокружения в сыворотке крови у больных ПКР в зависимости от стадии заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 66 больных ПКР, проходивших обследование и лечение в отделении онкоурологии НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ФГБОУ ВО «Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России. Общая характеристика больных с ПКР представлена в таблице 1. Все обследованные больные были разделены на две группы в соответствии со стадиями TNM. В первую группувошли пациенты с 12 стадиями заболевания и один больной с синхронным ПКР (38 пациентов), во вторую – с 3-4 стадиями (28 пациентов). Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (мужчин – 16, женщин – 14, средний

Таблица 1. Характеристика больных ПКР

Table 1. Characteristics of patients with RCC

Показатель Indicator Количество пациентов, n (%) Number of patients, n (%) Пол Gender Мужской / Male 36 (54,5) Женский / Female 30 (45,5) Cредний возраст – 60,9 лет, [37-77] Average age – 60.9 years, [37-77] Гистологический тип опухоли Histological type of tumor Светлоклеточный рак Clear cell cancer 66 (100) Степень дифференцировки Degree of differentiation G – 1 30 (45,5) G – 2 26 (39,4) G – 3 7(10,6) G – 4 3 (4,5) Тип роста опухолевого узла Type of tumornode growth Смешанный / Mixed 39 (59,1) Экстраренальный / Extrarenal 16 (24,3) Интраренальный / Intrarenal 11 (16,6) Стадия по TNM TNM Stage T – I 33 (50) pТ1аN0M0 16 pТ1bN0M0 17 T – II 4 (6,0) pТ2a N0M0 2 pТ2b N0M0 2 Синхронный ПКР pT2N0M0, T1N0M0 Synchronous RCC pT2N0M0, T1N0M0 1 (1,5) T – III 17 (25,8) pТ3aN0M0 14 pТ3bN1M0 2 pТ3cN1M0 1 Т – IV 11 (16,7) pT1N0M1 1 pT3aN0M1 7 T3bN0M1 1 T3сN0M1 1 T4N0M1 1 возраст – 56,6 лет). Исследуемые группы больных были сопоставимы по полу и возрасту.

Всем включенным в исследование больным ПКР проведено комплексное обследование согласно клиническим рекомендациямпо диагностике и лечению больных раком почек [13]. Морфологическое исследование полученного материала (после проведенного оперативного лечения) проводилось по стандартной технологии. При обзорном морфологическом анализе срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для определения гистологического типа опухоли, степени дифференцировки, выраженности вторичных изменений и распространенности опухолевого процесса по классификацию ВОЗ [14].

Исходя из комплекса результатов обследования отобраны пациенты, соответствующие следующим критериям включения:

• •    больные ПКР без подтвержденных метастазов и с метастазами со стадией заболеванияT1a-bN0M0, T2a-bN0M0, T3a-bN0-1M0, Т1-4N0M1;

• •    гистологический тип опухоли – светлоклеточный почечно-клеточный рак;

• •    отсутствие предшествующего и сопутствующего специального лечения (иммунотерапия или таргетная терапия).

Дополнительно до оперативного вмешательства пациентам основной и контрольной групп проведено определение в сыворотке кровиуровня медиаторов, вырабатываемых клетками МкО, методом твердофазного иммуноферментного анализа. Перечень исследуемых параметров представлен в таблице 2.

Для определения уровня в сыворотке крови TNFα INFγ, МСР-1, VEGF использовали коммерческие наборы

Таблица 2. Медиаторы МкО сыворотки крови

Table 2. Mediators of blood serum tumor microenvironment

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакетов прикладных программ Statis-tica 10 и SAS JMP 11. Для оценки изменения уровня медиаторов в сыворотке крови применяли методы описательной статистики с расчетом уровня достоверности различия между группами обследованных по критерию Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Чувствительность и специфичность медиаторов МкО определяли с помощью ROC-анализа с расчетом AUC (Area under ROC curve – площади под кривой). Значимым считали значение площади под ROC-кривой, превышающее 0,70. Критический уровень значимости p-value для всех используемых процедур принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования медиаторов опухолевого микроокружения были изучены для двух группа больных ПКР и представлены в таблицах 3 и 4. Как видно у больных ПКР уже на 1 и 2 стадиях заболевания имеет место нарастание в сыворотке крови уровня цитоки-нов/хемокинов и колониестимулирующих факторов за исключением содержания INFγ (табл. 3) по сравнению с группой условно здоровых. Уровень INFγ незначительно снижается у пациентов на 1-2 стадиях заболевания. Повышение уровня провоспалительных цитокинов, колониестимулирующих и факторов роста в сыворотке крови можно считать ассоциированным с опухолевым ростом воспалительным процессом на фоне сохраненной иммунной защиты МкО. У больных ПКР с3 и 4 стадиями ПКР заболевание сопровождается статистически значимыми сохранением высокого уровня в сыворотке крови цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов, снижением уровня INFγ и дальнейшим подъемом концентрации факторов роста подтверждающих прогрессию и диссеминацию опухолевого процесса. Уровни TGF-β1и VEGF у больных ПКР с 3-4 стадией заболевания превышали их содержание в группе сравнения и в группах пациентов с опухолевым ростом в пределах органа.

То есть, паракринный выход в кровоток многочисленных биоактивных молекул (цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов) или создание индуцированного злокачественными клетками профиля медиаторов воспаления вызывает экспрессию факторов роста.

Для подтверждения диагностического значения медиаторов изменения МкО в периферическом кровотоке построены ROC-кривые и посчитаны площади под ними (табл. 4). Величина площади под кривой для практически всех медиаторов, и факторов воспаления и факторов роста по экспертной шкале достигала хорошего качества прогностической модели прежде всего в группе пациентов с 1-2 стадиями с ПКР. Точки разделения больных с 1-2 стадиями заболевания (для G-CSF-69,3 пг/мл, GМ-CSF- 7,8 пг/мл, TNFα-3,9пг/мл, INFγ-17,5 пг/мл, МСР-1- 332 пг/мл, VEGF- 408,3 пг/мл TGF-β1- 49 550пг/мл) практически для каждого из им-мунорегуляторных медиаторов, характеризовали эти стадии с чувствительностью 100 до 60% и эффективностью от 87,3 до 66,4%. То есть результаты исследования медиаторов еще раз показали,что генетические изменения опухолевых клеток (утрата опухолевого супрессора VHL) определяет особенности МкО, превращая в опухоль с высокимуровнем инфильтрации Т-клетками [15, 16]. В группах пациентов с 3 и 4 стадиями ПКР наибольшие площади под кривой показали факторы роста – 94,4 до 100%. Точкой разделения для VEGF стала концентрация 404,2 – 527,2 пг/мл, с чувствительностью 100-82,5% и эффективностью 92,3 – 71,3%, для TGF-β1-49 550 – 58 500 пг/мл, с чувствительностью 94,4% и эффективностью 79,6 – 89,1%.

Таблица 3. Уровень иммунонорегуляторных медиаторов в сыворотке крови у больных ПКР до оперативного вмешательства Table 3. The level of immunoregulatory mediators in the blood serum of patients with RCC before surgery

Показатель, пг/мл Indicator, pg/ml	M ± S Контрольная группа Control group	M ± S 1-2 стадия 1-2 stage of cancer	M ± S 3-4 стадия 3-4 stage of cance	Уровень P (df=3) Level P (df=3)	Уровень P (Контрольная группа/ 1-2 стадии ПКР) Level P (Control group/ 1-2 stage of cancer)	Уровень P (Контрольная группа/ 3-4 стадии ПКР) Level P (Control group/ 3-4 stage of cancer)
TNFa	2,50 ± 1,12	7,87 ± 3,14	8,56 ± 2,69	<0,0001	<0,0001	<0,0001
INFγ	22,07 ± 3,79	19,96 ± 3,69	14,17 ± 2,02	<0,0001	0,6539	<0,0001
МСР-1	190,08 ± 90,14	345,28 ± 110,23	348,62 ± 116,05	<0,0001	0,0003	0,0010
G-CSF	7,88 ± 3,12	135,63 ± 41,55	126,79 ± 28,34	<0,0001	<0,0001	<0,0001
GM-CSF	1,03 ± 0,22	11,52 ± 2,96	7,58 ± 1,87	<0,0001	<0,0001	0,0050
VEGF	316,57 ± 93,52	295,01 ± 102,55	661,49 ± 427,25	<0,0001	0,9717	0,0267
TGF1β	28 910,00 ± 16 642,02	33 442,00 ± 8 341,03	61 182,35 ± 17 306,79	<0,0001	0,4043	<0,0001

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленное нарастание в сыворотке крови содержания цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов за исключением INFγ уже на 1-2 стадиях ПКР или в периоде разрастания опухолевых клеток в пределах органа можно считать следствием начального этапа взаимодействия генетически измененных раковых и иммунных клеток МкО. Паракринная секреция многочисленных биоактивных молекул клетками МкО формирует нарастание провоспалительных цитоки-нов/хемокинов в сыворотке крови. Совершенно очевидно, что подъем уровня медиаторов воспаления в периферическом кровотоке приводит к изменению активности противоопухолевого иммунного ответа.Он создает среду для экстравазации и метастазирования злокачественных клеток. То есть мутационные изменения гена Фон Хиппель-Линдау ( VHL ) или потеря опухолевого супрессора VHL у больных ПКР с одной стороны приводит в движение гипоксический путь, усиливающий ангиогенез и гиперваскуляризацию опухолевой ткани, с другой – превращает опухолевую ткань в «горячую» или иммуно-инфильтрированную опухоль с высокими содержанием ТАМ и инфильтрацией Т-клетками [17-19]. Это приводит к вышеописанному нарастанию в периферическом кровотоке содержания цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов уже на 1-2 стадиях ПКР.

Такая перестройка цитокиновой сети МкОу больных ПКР сопровождает развитие ЭМП, появление автономной цитокиновой сети, прогрессией опухолевого роста и метастазированием [20]. У больных с 3-4 стадиями ПКР перестройка системыиммуннойзащиты, по-видимому, вследствие как роста самой опухолевой ткани так и числа ТАМ, сопровождается нарастанием содержание факторов роста, TGF-β1 и VEGF в сыворотке крови [21]. Установленные особенности изменения в периферическом кровотоке содержания медиаторов иммуноре-гуляторных процессов представляют дополнительную информацию активности опухолевого роста и характеризуют нарушение состояния иммунной системы МкО. Медиаторы МкО (TNF-α, МСР-1, G-CSF, VEGF, TGF-β1) сыворотки крови обладают оптимальным соотношением чувствительности и специфичности при у больных ПКР что позволяет получить дополнительную информацию об активности неопластического процесса.

ВЫВОДЫ

• 1.    Рост опухолевых клеток на начальных стадиях ПКР сопровождается значимым увеличением уровня провоспалительных цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов в сыворотке крови. При прогрессировании опухолевого роста у больных ПКР имеет место активация выброса в кровоток таких факторов роста как TGF-β1 и VEGF.

• 2.    Попадающие в периферический кровоток медиаторы МкО (цитокины/хемокины, колониестимулирующие и факторы роста) относятся к прогностическим показателям для оценки эффективности иммунотерапевтических технологий лечения опухолевых заболеваний.

Таблица 4. Влияние стадии ПКР до оперативного вмешательства на уровень иммунорегуляторных медиаторов в сыворотке крови

Table 4. The effect of the RCC stage before surgery on the diagnostic level of immunoregulatory mediators in the blood serum

Показатели Indicators	Точка отсечения, пг/мл Cut-off point, pg / ml	Au ROC	Чувствительность Sensitivity	Специфичность Specificity	Эффективность Effectiveness	Хи-квадрат Chi-square	Уровень P Level P (df=1)
Контрольная группа/ группа с 1 и 2 стадией ПКР Control group/1-2 stage of RCC
TNFa	3,9	0,68	96%	38%	67,09%	10,1	0,0015
INFγ	17,5	0,71	80%	65%	72,73%	14,2	0,0002
МСР-1	332,0	0,68	60%	72%	66,36%	7,9	0,0051
G-CSF	69,3	0,72	100%	38%	69,09%	12,9	0,0003
GM-CSF	7,8	0,92	100%	74%	87,27%	38,2	<0,0001
VEGF	408,3	0,79	96%	69%	82,55%	29,1	<0,0001
TGF1b	49 550,0	0,68	96%	54%	75,27%	18,5	<0,0001
Контрольная группа/ группа с 3-4 стадией ПКР Control group/3-4 stage of RCC
TNFa	4,6	0,74	100%	44%	72,22%	11,6	0,0007
INFγ	15,3	0,84	82%	79%	80,86%	22,8	<0,0001
МСР-1	195,4	0,67	100%	34%	67,46%	8,2	0,0042
G-CSF	103,0	0,67	88%	49%	68,72%	7,7	0,0054
GM-CSF	5,7	0,54	0,00%	68%	34,13%	7,2	0,0073
VEGF	408,3	0,67	82%	60%	71,34%	9,8	0,0018
TGF1b	38 400,0	0,76	94%	65%	79,60%	18,8	<0,0001

ЛИТЕ РАТУPA/REFEREN CE S

Сведения об авторах:

Захарова Н.Б. – д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Саратовского государственного медицинского университета им.

Вклад авторов:

Захарова Н.Б. – концепция, дизайн исследования, проведение и обработка результатов лабораторных исследований, 25%

Понукалин А.Н. – сбор материала, обработка данных, 25%

Чехонацкая М.Л. – подготовка к публикации, 15%

Комягина Ю.М. – статистическая обработка данных, 20%

Бучарская А.Б. – редактирование, 15%

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: Работа выполнена в рамках государственного задания Рег. №121032600197-2.

Статья поступила: 27.08.21

Результаты рецензирования: 22.10.21

Исправления получены: 22.11.21, 6.01.22, 7.01.22

Принята к публикации: 17.02.22

Information about authors:

Zakharova N.B.– PhD,MD, Professor,Head of Scientific Research Laboratory, Department of ClinicalLaboratory Diagnostics, Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky; Saratov, Russia; ; 0000-0001-9410-2240.

University n.a. V.I.Razumovsky; Saratov, Russia; ;

Chekhonatskaya M.L. – PhD, MD, Professor, Department of radiation diagnostics and radiation therapy, Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky; Saratov, Russia; ;

Bucharskaya A.B. – DR. Sci., Deputy Director of the Research Institute of Uronephrology