Дифференциальная диагностика острого панкреатита тяжелого течения и молниеносного панкреатита методом атомно-силовой микроскопии

Острый панкреатит тяжелой степени – особо опасная форма острого панкреатита, с высокой долей вероятности переходящая в панкреонекроз, что требует ранней диагностики данного состояния с незамедлительным применением всех необходимых медикаментозных и хирургических мероприятий (1–2). Несмотря на досконально разработанный алгоритм лечения летальность при тяжелом панкреатите может достигать 50 % (3). Одной наиболее плохо прогнозируемых форм острого панкреатита по-прежнему остается так называемый молниеносный панкреатит (4).

Углубленное изучение патогенеза острого панкреатита по правилам доказательной медицины, имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Одним из направлений исследований является получение достоверных сведений о состоянии мембраны клеток (6). Изучение изменений мембраны клетки может способствовать развитию новых способов ранней диагностики острого панкреатита и определению степени тяжести последнего, что, в свою очередь, будет способствовать выбору оптимального способа лечения на ранних сроках заболевания и прогнозировать течение заболевания (7–8). В настоящее время все большее внимание уделяется атомносиловой микроскопии эритроцитов при многих заболеваниях, в том числе и при панкреатите различной степени тяжести. Атомно-силовая микроскопия дает возможность получить информацию о поверхностном заряде и емкости, проводимости, магнитных и адгезивных свойствах клеточной мембраны и ее целостности. Так как изменения в эритроците, особенности в мембране клетки аналогичны изменениям во всех клетках пациента, то по степени нарушений в эритроците можно косвенно судить о нарушениях и в клетках поджелудочной железы и таким образом судить о степени тяжести течения острого панкреатита (9). Нарастание патологических изменений эритроцитарной мембраны свидетельствует об утяжелении течения панкреатита даже при отсутствии клинических и лабораторных свидетельств (10).

Цель исследования – соотнести данные атомно-силовой микроскопии мембраны эритроцита и степень тяжести острого панкреатита для прогнозирования и раннего выявления утяжеления течения.

Материалы и методы

Были выделены 2 группы больных острым панкреатитом с длительностью заболевания от трех суток от начала заболевания до момента госпитализации (31 пациента с диагнозом ОПТС (контрольная группа) и менее 24 часов (молниеносная форма) (27 больных с диагнозом ОПТС (основная группа). Проведён сравнительный анализ групп по возрасту, полу и основным показателям исходного состояния пациентов.

Статистически значимых различий между группами не получено.

Лабораторная диагностика включала общий анализ крови, анализ мочи, биохимический анализ крови. Также всем без исключения пациентам проводилось ультразвуковое исследование брюшной полости и поджелудочной железы и компьютерная томография с ангиографией.

Тяжесть общесоматического состояния больных острым панкреатитом определяли с помощью шкалы APACHE II.

С целью выявления и оценки ранних объективных признаков тяжёлого течения острого панкреатита использовали шкалу Ranson.

Для оценки выраженности развившейся органной недостаточности использовали шкалу SOFA — Sepsis-related Organ Failure.

В рамках проводимого исследования проводилась оценка состояния эритроцитов периферической крови пациентов и сравнение с эритроцитами здоровых людей методом атомно-электронной микроскопии на атомно-силовом микроскопе Integra Aura (NT-MDT, Россия). Для получения изображений использовано программное обеспечение АСМ NOVA, для анализа изображений – программу Image Analysis.

Оценка полученных данных проводилась путем статистической обработки с применением пакета прикладных программ Statistica 7. Распределение признаков определялось применением критерия Шапиро-Уилка. Описательная статистика при нормальном распределении выражается средними арифметическим и стандартным отклонениями. При распределении, отличающемся от нормального – медианой и квартилями. Дисперсионный анализ с последующими парными сравнениями групп по критерию Шеффе применяли при статистической значимости различий между показателями нормально распределенных независимых выборок. Критерий Краскела-Уоллиса и парные сравнения по критерию Манна-Уитни применяли при отсутствии нормального распределения. Поправку Бонферрони использовали при статистической значимости различий при множественных сравнениях. Статистически значимым уровнем различий при сравнении 3-х групп считали p<0,017.

Результаты

Пациенты обеих групп были госпитализированы в первые трое суток от начала заболевания. При этом пациенты основной группы поступили в стационар не позднее 24 часов от начала болезни. При проведении статистической обработке получены статистически значимые различия в частоте встречаемости ранней госпитализации: раннее поступление в стационар чаще было характерно для «молниеносного течения» (p<0,05).

Тяжесть состояния пациентов определялась по интегральным шкалам APACHE II, Ranson и SOFA через 48 часов после поступления в стационар (табл. 1).

Статистически значимое преобладание пациентов с молниеносным течением было выявлено при превышении порогового значения по шкале Ranson больше 8, по шкале SOFA больше 7 баллов включительно.

Статистически значимых изменений в анализах крои и мочи при поступлении не отмечалось (табл. 2).

У всех пациентов проводилось исследование эритроцитов периферической крови. При этом проводилось сравнение с эритроцитами крови практически здоровых людей (доноров). Исследование проводилось методом атомно-силовой микроскопии. Сравнивались линейные объемы эритроцитов, показатели объема и состояние клеточной мембраны эритроцита.

аблица 1

Тяжесть состояния больных через 48 часов после поступления в стационар

Table 1

The severity of the patients’ condition 48 hours after admission to the hospital

Группы/Groups	Средний балл тяжести состояния по шкалам (M+δ)/Average score of severity of the condition according to scales (M+δ)
	APACHE II	Ranson	SOFA
Контрольная/ Control (n=32)	11,4±2,2	6,9±2,1	5,1±2,4
Основная/The main (n=27)	13,1±4,3	8,9±3,1	7,1±1,8

Таблица 2

Лабораторные показатели

Laboratory parameters

Table 2

	Контрольная/ Control (n=32)	Основна/The main (n=27)
АЛТ/ALT	84,3±11,7	90,5±13,1
АСТ/AST	92,6±15,3	99,3±14,1
Общий белок/Total protein	68,9±2,1	74,3±4,3
Общий билирубин/Total bilirubin	35,7±12,3	41,7±13,6
Сахар крови/Blood sugar	8,2±0,4	8,8±0,6
Креатинин/Creatinine	112,3±10,3	136,7±12,4
Мочевина/Urea	7,6±0,5	7,9±0,6
Амилаза крови/Blood Amylase	519,8±123,8	556,9±135,4
Амилаза мочи/Urine Amylase	2157±753,6	2356±815,4
Гемоглобин/ Hemoglobin	151,4±4,7	182,7±4,1
СОЭ/erythrocyte sedimentation rate	20,5±3,1	24,3±3,9
Лейкоциты Leukocytes х 109/л/	15,2±0,9	17,8±0,7
Лимфоциты/lymphocytes абс	43,3±0,1	50,4±0,3
Моноциты/monocytes абс/	7,1±0,8	7,8±0,6
Палочкоядерные нейтрофилы/Rod-shaped neutrophils абс	2,3±0,3	2,8±0,2
Тромбоциты/Platelets х 109/л/	297,3±37,1	305,4±40,6
ЛИИ/leukocyte index	7,4±0,6	7,8±0,4

Большинство эритроцитов здоровых людей имели двояковогнутую форму в виде дискоцита. Форма эритроцита больных острым панкреатитом как в основной, так и в контрольной группах не отличалась от формы эритроцитов здоровых людей (табл. 3).

Таблица 3

Сравнение линейных размеров эритроцитов

Comparison of linear sizes of erythrocytes

Table 3

	Длина, мкм/Length, microns (М ± m, µм)	Ширина/ Width, мкм (М ± m, µм)	h, max, нм (М ± m, ηм)	h, min, нм (М ± m, ηм)	Глубина впадины/Depth of depression, мкм (М ± m, ηм)
Здоровые/Healthy (n=30)	8,72 ±0,1	8,54±0,16	348 ±1,9	162,5±5,9	185,5± 4,3
Контрольная/Control (n=31)	8,74±0,07	8,46±0,17	348,6±0,14	160,8±7,2	184,9±4,97
Основная/The main (n=27)	8,71±0,0,08	8,44±0,13	347,4± 0,13	161,8±6,1	184,3±4,89
	p1-2=0,939 p1-3=0,924	p1-2=0,830 p1-3=0,819	p1-2=0,760 p1-3=0,743	p1-2=0,935 p1-3=0,986	p1-2=0,854 p1-3=0,851

Длина, ширина и глубина впадины эритроцита имели незначительные изменения в пределах статистической погрешности.

Средний объем эритроцита здоровых людей составил 12,15 мкм3, а адгезивные силы, рассчитанные программой Nova ACM Integra Aura (ЗАО «НТ-МДТ», Россия), эритроцита здоровых людей составил 1,74+0,03 нН (табл. 4).

Таблица 4

Сравнение объема эритроцитов и состояния эритроцитарной мембраны

Comparison of the volume of erythrocytes and the state of the erythrocyte membrane

Table 4

	Площадь эр-та, мкм2 (М ± m, µкм2)	Объём эр-та, мкм3 (М ± m, µкм3)	Кол-во эрозий на 4х4хнм (М ± m)	Длина эрозий, мкм (М ± m, µкм)	Ширина эрозий, мкм (М ± m, µкм)	Глубина эрозий, мкм (М ± m, µкм)
Здоровые/Healthy (n=30)	44,97±1,2	12,09±0,29	0	0	0	0
Контрольная/ Control (n=31)	45,3± 1,2	13,15±0,43	12±2	0,44±0,3	0,36±0,2	0,41±0,3
Основная/The main (n=27)	45,2±1,01	13,12± 0,31	21±5	0,48±0,4	0,38±0,3	0,49±0,4
	p1-2=0,946 p1-3=0,941	p1-2=0,932 p1-3=0,929	p1-2<0,001 p1-3<0,001	p1-2<0,001 p1-3<0,001	p1-2<0,001 p1-3<0,001	p1-2<0,001 p1-3<0,001

Если площадь поверхности эритроцита практически не изменилась, то объем последнего увеличился за счет стремления к сфероцитозу. Чем тяжелее течение заболевания, тем больше сфероцитов обнаруживаются в мазке крови.

В отличие от эритроцитов здоровых людей на поверхности мембраны эритроцитов пациентов с острым панкреатитом появляются эрозии. Причем их количество, площадь и глубина увеличиваются прямо пропорционально степени тяжести течения.

Методом атомно-силовой микроскопии проведено сканировании поверхностной мембраны эритроцитов. При полу- чении изображений выявлено, что в отличие от эритроцитов здоровых людей при тяжелом течении панкреатита на эритроцитарной мембране отмечаются эрозии. При молниеносном панкреатите количество эрозий в разы увеличивается, площадь и глубина также становится больше (рис. 1). Все указанные изменения являются статистически значимыми. Таким образом применение атомно-силовой микроскопии эритроцитов в клинической практике может оказать значимую помощь в дифференциальной диагностике степени тяжести течения острого панкреатита.

Рис. 1. 3D сканы поверхности эритроцитов, полученных при атомно-силовой микроскопии

Fig. 1. 3D scans of the surface of erythrocytes obtained by atomic force microscopy

Заключение

Клиническая картина, данные лабораторных и стандартных методов инструментального обследования далеко не всегда позволяют с точностью определить тяжесть течения заболевания, что может негативно повлиять на выбор тактики лечения и на своевременное решение вопроса об оперативном лечении, что в конечном итоге может привести к развитию тяжелых гнойно-некротических осложнений и смерти пациента. Особую сложность в диагностике вызывает молниеносная форма панкреатита в связи со скоростью развития заболевания и отсутствии выраженных специфических клинических проявлений.

Существенную помощь в диагностике и дифференциальной диагностике острого панкреатита тяжелой степени и молниеносной формы может оказать внедрение в клиническую практику атомно-силовой микроскопии эритроцитов периферической крови. Увеличение объема эритроцитов, появление эрозий больших по площади и глубине, а также увеличение эрозий при проведении динамического исследования свидетельствует о развитии молниеносной формы панкреатита. Своевременное правильное установление степени тяжести течения острого панкреатита позволит изменить тактику лечения больных и улучшить как непосредственные, так и отдаленные результаты.