Динамика активности аскорбатпероксидазы листьев томата в условиях пониженных температур и после их действия

Растения реагируют на воздействие абиотических факторов и биопатогенов генерацией активированных форм кислорода, что сопровождается развитием в растениях признаков окислительного стресса [1]. Природа возникновения окислительного повреждения при стрессе до сих пор остается недостаточно изученной. Механизмы, посредством которых радикалы кислорода разрушают липидные мембраны и повреждают белки, в основном связывают с реакциями перекисного окисления. Сбалансированность перекисным окислением, с одной стороны, и антиоксидантной активностью – с другой, является необходимым условием для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки. Любое внешнее воздействие вызывает усиление свободнорадикальных процессов и смещение равновесия в сторону активации перекисного окисления [3].

Для защиты от окислительного стресса растительные клетки содержат конъюгированные ферменты, динамика которых меня- ется в зависимости от степени воздействия стресса [2]. Одним из таких ферментов является аскорбатпероксидаза (АПО), локализованный в хлоропластах, митохондриях, микротельцах и цитозоле. Он является основным ферментом, утилизирующим перекись водорода у растений [4].

Целью настоящего исследования стало изучение активности аскорбат-пероксидазы в листьях томата ( Lycopersicon esculentum L.) сортов Подарочный, Патрис, Волгоградский в условиях низких положительных температур и после их действия.

Методика постановки эксперимента . Растения выращивали в лабораторных условиях в сосудах с почвой объемом 1 м³ до фазы 3–4-го листа. Температура выращивания составляла 24–25 °C, освещение люминесцентными лампами – 2 800 лк, влажность воздуха – около 80 %. Почва – среднесуглинистый деградированный чернозем. Полив осуществлялся по мере высыхания почвы. После достижения фазы 3-го настоящего

листа (возраст растений – 21 день) изменяли условия опыта: 1-я группа (контрольная) – растения выращивали при t + 25 °C, 2-я группа – растения выращивали при t +10 °C, 3-я группа – при t +3 °C. Охлаждение продолжалось в течение трех суток. После охлаждения растения переносили в оптимальные температурные условия. Сразу после охлаждения у 24-дневных растений и спустя трое суток после него – у 27-дневных растений определяли активность аскорбатпероксидазы по методике Y. Nakano, K. Asada (1981) с некоторыми модификациями. 1г листьев растирали на холоде с 10 мл фосфатного буфера (pH 7,6), добавляли 0,3 г поливинилпирролидона, затем фильтровали и центрифугировали 10 мин при 12 000 g. Реакционную смесь составляли из 50,0 мкл 0,1 мМ ЭДТА, 50,0 мкл 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 50,0 мкл 0,1 мМ перекиси водорода, 2,25 мл фосфатного буфера (pH 7,6) и 300,0 мкл растительного экстракта, полученного после центрофуги-рования гомогената. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 290 нм против контроля без ферментного экстракта. Коррекцию неферментативного окисления аскорбата (в от- сутствии перекиси водорода) не делали, так как оно не превышало 5 %. Для расчета активности АПО брали понижение оптической плотности за первые 30 сек. реакции с последующим расчетом активности в ммоль/г навески в 1 мин с использованием коэффициента молярной экстинкции, равной 2,8 мМ-1 см-1 [Там же].

Все определения проводили в двух отдельных опытах, каждый из которых состоял из трех биологических повторностей. Каждая биологическая повторность представляла усредненную навеску листьев с 6–8 растений. Статистическую обработку проводили на компьютере с использованием программы «MS Office 2003». Значения в таблицах – среднее арифметическое из всех опытов с их стандартными ошибками.

Результаты исследований показали, что при понижении температуры до +10 °С в листьях 24-дневных растений томата сорта Подарочный активность АПО увеличилась в более чем 2 раза по сравнению с контролем. При действии температуры +3 °С активность изучаемого нами фермента превышала контрольные значения уже почти в 4 раза (таблица).

Таблица

Влияние пониженных температур на активность аскорбатпероксидазы у растений томата, ммоль/г ткани, мин

У растений сорта Патрис при температуре до +10 °С активность АПО увеличилась в меньшей степени по сравнению с предыдущим сортом на 11 % относительно контроля. Выдерживание растений при t +3 °С привело к увеличению значения активности АПО почти в 2,5 раза по сравнению с контролем.

У сорта Волгоградский отмечалась сходная картина: при понижении температуры до +10 °С активность АПО увеличивалась на 31 % по сравнению с контролем. При помещении растений в более низкотемпературные условия (3 °С) активность АПО была в 2,5 раза выше по сравнению с контролем.

В контрольном варианте у 27-дневных растений всех сортов при увеличении продолжительности вегетации происходило увеличение активности фермента в 2 раза. В последействии низкотемпературного стресса активность аскорбатпероксидазы продолжала уменьшаться. После воздействия t +10 °С у растений выше указанного возраста сорта Подарочный активность АПО увеличилась в 3 раза по сравнению с контролем. После действия t +3 °С через трое суток у листьев томата активность АПО увеличилась в большей степени, чем в момент действия этой температуры – почти в 4,5 раза по сравнению с неохлажденными растениями.

У листьев 27-дневных растений сорта Патрис в контрольном варианте значения АПО по сравнению с 24-дневными растениями не изменились. В последействии температурного стресса (10 °С) активность АПО увеличилась на 63 % по сравнению с контролем. После действия более низкой температуры (3 °С) активность АПО увеличилась в 3 раза по сравнению с контролем.

У 27-дневных растений сорта Волгоградский в контрольном варианте по мере продолжительности вегетации происходило незначительное увеличение уровня активности АПО. Однако, в последействии низкотемпературного стресса активность аскорбатпероксидазы резко увеличивалась. В последействии t +10 °С активность фермента увеличилась в 2 раза. Через трое суток после воздействия t 3 °С активность АПО увеличилась в 3 раза по сравнению с контрольными растениями.

Анализ полученных результатов показал, что фермент аскорбатпероксидаза вносит определенный вклад в репарацию растений томата в ходе окислительного стресса, который был спровоцирован стрессовыми температурами. При этом по мере снижения температурного воздействия на растения повышалась активность аскорбатпероксидазы.

У неохлажденных растений наблюдали небольшие различия по активности данного фермента между изученными сортами. Однако при этом в листьях томата сорта Подарочный активность АПО была максимальной. При действии пониженных положительных температур у всех сортов было отмечено увеличение активности АПО как при действии стресса, так и после него. В целом у 24-дневных растений активность фермента увеличилась в 1,5–2,0 раза при действии t +10 °С и в 2,5–4,0 раза при действии t +3 °С по сравнению с контролем. В последействии охлаждения активность АПО превышала аналогичные показатели у 27-дневных растений в 2–3 раза при t +10 °С и в 3,0–4,5 раза при t +3 °С по сравнению с контролем. Возможно, в этот период в растениях томата усиливался синтез изоформ АПО, направленный на снижение концентрации перекисей и защиту от окислительного стресса. Особенно заметное воздействие было отмечено у растений томата сорта Подарочный, что является показателем большей устойчивости этого сорта к пониженным температурам.

Таким образом, увеличение активности аскорбатпероксидазы при охлаждении растений томата связано с развитием окислительного стресса, который, в свою очередь, приводит к развитию холодового повреждения.

В последействии низкотемпературного стресса прослеживалась тенденция к дальнейшему увеличению активности антиоксидантного фермента. По мере снижения температуры охлаждения повышалась активность АПО. Это может быть связано с тем, что фермент высокоспецифичен к аскорбату и быстро теряет активность в его отсутствие. Возможно, действие низких температур на растения обусловливает накопление в них значительного количества ас-кробата. При этом различия в реакциях АПО на действие пониженных температур различных сортов томата объясняются их структурнофункциональными особенностями.