Динамика микрофлоры желудочно-кишечного тракта телят при применении кормовой добавки

Одной из проблем современного животноводства для всех видов сельскохозяйственных животных является обеспечение высокой сохранности молодняка, особенно телят в ранний постнатальный период [1]. В общей структуре патологий молодняка крупного рогатого скота ведущее место занимают желудочно-кишечные болезни, проявляющиеся симптомокомплексом диареи и приводящие к задержке развития больного теленка, замедлению прироста живой массы, значительным материальным затратам на кормление таких телят и проведение лечебно-профилактических мероприятий [2].

Качественный и количественный состав микроорганизмов в кишечнике телят до первого приема молозива схож с микробиологическим статусом родовых путей матерей [3]. В организм новорожденных попадают разнообразные микроорганизмы, как полезные и безвредные, так и условно патогенные и патогенные. Равновесие микрофлоры новорожденного животного неустойчивое, легко может нарушиться даже при незначительной стрессовой ситуации [4]. В результате наблюдается интенсивное развитие условно патогенной и патогенной микрофлоры, проявляющееся в первую очередь расстройством пищеварения [5].

Несмотря на значительное количество исследований, связанных с проблемой желудочно-кишечных болезней телят, она до сих пор не решена, о чем свидетельствуют их высокая заболеваемость и гибель [6].

Для профилактики желудочно-кишечных болезней проводится постоянный поиск новых препаратов и способов их применения [7]. Перспективным направлением в области терапии и профилактики желудочно-кишечных патологий молодняка является нормализация микрофлоры [8].

Цель работы – изучить влияние препарата «Гуматэн» на микрофлору желудочнокишечного тракта телят в ранний постнатальный период.

Материалы и методы

Исследования проводили в производственных условиях в одном из хозяйств Омской области. Объектом исследований служили телята с 2-дневного возраста голштинской и красной степной голштинизированной пород, из которых по принципу аналогов были сформированы две группы по пять голов в каждой (опытная и контрольная). Животные находились в одинаковых условиях содержания (индивидуальные клетки, имеющие толстый слой сухой пшеничной или ржаной соломы) и кормления (двукратно выпойка молозива через 1,5–2 и 10 ч после рождения). Затем выпаивали сквашенное молоко со 2-е по 10-е сут, в последующем телята были переведены на трехразовый рацион питания. В возрасте 1–1,5 недель в рацион вводят овес и постепенно дробленку. Телятам опытной группы (n = 5) выпаивали препарат «Гуматэн» (предварительно размешивая его в молоке) два раза в день в дозе 0,5–1 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд (табл. 1). Телята контрольной группы (n = 5) находились на обычном рационе.

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Таблица 1

Схема применения препарата «Гуматэн» для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта у телят

Кол-во голов	Препарат	Кратность, дозы и метод введения	Кратность введения препарата (сут)
Опытная группа
n = 5	Гуматэн	Двукратно в дозе 0,5–1 мл/кг массы тела, внутрь с молоком	1, 2, 3, 4, 5-е, в течение 5 сут

Гуматэн представляет кормовую добавку, полученную из переработанного сырья природного происхождения; в его составе гувитан, пропиленгликоль и янтарная кислота. Биологически активные вещества оказывают на организм молодняка общее стимулирующее (тонизирующее) действие за счет содержащихся в гидролизате комплексов органо-минеральных веществ сложной структуры, обеспечивающих активацию защитных механизмов организма, оптимизацию процессов пищеварения и всасывания компонентов рациона.

По данным производителя, гуматы улучшают работу пищеварительного тракта. С одной стороны, гуматэн действует как энтеросорбент и выводит из организма токсичные соединения, с другой, улучшает усвоение питательных веществ и активизирует микрофлору кишечника. В совокупности эти эффекты нормализуют работу пищеварительного тракта, повышаются коэффициент переваривания корма и сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам.

Пропиленгликоль, входящий в состав гуматэна, – наиболее изученная глюкоген-ная добавка, некоторые исследователи отмечают, что у него могут присутствовать антибактериальные и противогрибковые эффекты. Оказывается бактерицидное действие и на ряд бактерий, в том числе на E. coli.

Янтарную (сукциновую) кислоту относят к группе двухосновных предельных карбоновых кислот. Она участвует в ряде биохимических реакций энергетического, структурного и ферментного обеспечения организма, стимулирует рост животных и повышает резистентность их организма.

Исследования проводили в два этапа. На первом этапе в начале эксперимента от всех животных (опытных и контрольных) были взяты пробы фекалий из прямой кишки для изучения микробиоценоза пищеварительного тракта в постнатальном периоде. На втором этапе, после завершения применения препарата, вторично были отобраны пробы для изучения качественного и количественного состава микрофлоры желудочнокишечного тракта.

Материалом для бактериологического исследования являлись пробы фекалий, которые отбирали из прямой кишки с помощью стерильных тупферов. Пробы помещали в транспортную среду и в сумке-холодильнике доставляли в лабораторию. Бактериологические исследования проводили на базе БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория».

Выделение, культивирование, идентификацию и количественный учет полезных, условно патогенных и патогенных микроорганизмов желудочно-кишечного тракта телят осуществляли согласно методическим указаниям [9].

Для количественного подсчета пробы фекалий разводили физиологическим раствором в соотношении 1 : 10, затем готовили ряд последовательных разведений от 10–1 до 10–8 [10]. Посев биоматериала проводили на простые, специальные и дифференциально-диагностические питательные среды: МПА (мясо-пептонный агар), МПБ (мясопептонный бульон), кровяной агар, агар Эндо, Плоскирева, лактобакагар и бифидоагар, ВСА (висмут-сульфит агар), солевой агар и среду Сабуро. Культивирование осуществ-

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY ляли при температуре 30–37°С в течение 24–48 ч с последующим выделением чистых культур. У колоний, выросших на плотных питательных средах, описывали размер, форму, края, цвет, профиль, структуру, консистенцию, поверхность, наличие или отсутствие блеска. На жидких средах отмечали прозрачность, характер придонного и поверхностного роста микроорганизмов. Морфологические и тинкториальные свойства изучали в мазках-препаратах, окрашенных по Граму, наличие капсул и спор – по Ольту и Шефферу – Фултону, подвижность – в препаратах «висячая капля» [11].

Ферментативные свойства выделенных культур энтеробактерий определяли с использованием тест-системы Rapid для биохимической идентификации энтеробактерий. Тест-система основана на микрообъемной технологии с использованием жидких дифференциальных сред, содержащих только те субстраты, ферментация которых бактериями завершается немедленно или при инкубации в течение 4 ч. Сокращение сроков исследования достигается также за счет большой посевной дозы бактерий и малого объема среды. Система состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками с дегидратированными субстратами для определения 20 тестов. Результаты учитывают визуально по изменению окраски среды через 4 ч инкубации при 36°С. Идентифицируют бактерии по результатам тестов по специальной таблице.

Определение чувствительности выделенных микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам проводили диско-диффузионным методом с использованием агара Гивенталя – Ведьминой (АГВ) и стандартных бумажных дисков, пропитанных антимикробными препаратами, руководствуясь клиническими рекомендациями по определению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (Москва, 2015) и в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Патогенность выделенных культур микроорганизмов определяли при посеве на кровяной агар и постановкой биопробы на лабораторных животных: внутрибрюшинно вводили 0,5 мл бактериальной суспензии в концентрации 0,5 ∙ 109 м.т./мл. Контрольным животным вводили 0,5 мл стерильного 0,9%-ного физиологического раствора, срок наблюдения – 5 сут.

Результаты исследований

На первом этапе исследования микрофлоры желудочно-кишечного тракта телят нами был определен видовой и количественный состав микроорганизмов, представленный бифидо-, лактобактериями, стафилококками, эшерихиями и протеем (табл. 2).

Таблица 2

Видовая и количественная характеристика состава кишечной микрофлоры молодняка КРС (2-4-сут телята) до применения препарата, КОЕ/г

№ теленка	Bifidobacterium spp.	Lactobacillus spp.	E. coli	Staphylococcus spp.	Proteus spp
Опытная группа
318	107	106	4,9 ∙ 105	1 ∙ 103	1 ∙ 104
316	108	107	2,4 ∙ 107	–	1 ∙ 103
324	106	106	1,8 ∙ 106	>1 ∙ 105	–
23320	106	106	1,4 ∙ 105	1 ∙ 102	1 ∙ 103
317	109	107	1,4 ∙ 108	–	–
Контрольная группа
313	108	106	1,3 ∙ 106	>1 ∙ 105	1 ∙ 104
21316	106	106	4,8 ∙ 104	1 ∙ 103	1 ∙ 103
21329	108	106	5,7 ∙ 106	1 ∙ 103	1 ∙ 103
333	106	107	5,1 ∙ 105	–	1 ∙ 103
21328	109	107	4,3 ∙ 106	–	–

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Так, микрофлора фекалий исследуемых телят, не подверженных влиянию препарата, была представлена Bifidobacterium spp .: 10⁶–10⁹ КОЕ/г, Lactobacillus spp. : 10⁶–10⁷ КОЕ/г, в целом это соответствует нормативным показателям. Содержание Escherichia coli – в пределах от 5,7 ∙ 10⁶ до 1,3 ∙ 10⁶ КОЕ/г.

У исследуемых телят (возраст – 2–4 сут.) отмечали увеличение количества условно патогенной микрофлоры, а именно Staphylococcus spp .: у трех животных (30%) это показатель верхней границы нормы – 1 ∙ 10³ КОЕ/г, а у двух (20%) – более 1 ∙ 10⁵ КОЕ/г, у одного теленка опытной группы выделена патогенная культура Escherichia coli О115. У семи животных выделены микроорганизмы рода Proteus: 1 ∙ 10³–1 ∙ 10⁴ КОЕ/г, представленные видами P. mirabilis (57%) и P. vulgaris (43%).

Идентификацию выделенных культур проводили с учетом характера роста на плотных и жидких питательных средах и биохимических свойств. Так, культуры Escherichia coli при культивировании на МПБ вызывали помутнение среды с образованием осадка, который легко разбивался при встряхивании пробирки.

На МПА через 24 ч появлялись сочные, круглые, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью (S-форма) серо-белого цвета колонии диаметром 2–3 мм.

На среде Эндо лактозопозитивные штаммы E. coli образовывали колонии темновишневого цвета с металлическим блеском (рис. 1).

Рис. 1. Культура Escherichia coli. , выделенная из фекалий теленка № 317 (агар Эндо, +37°, 24 ч)

Бактерии рода Proteus на МПБ образовывали поверхностную пленку, на МПА был выражен феномен роения – вуалеобразный налет в виде концентрических колец роста по периферии центральной колонии. Поверхность таких колоний была покрыта тонким слоем налета с голубоватым оттенком.

На среде Плоскирева протей формировал изолированные, крупные, правильной формы, слегка выпуклые, полупрозрачные колонии желтовато-розового цвета (рис. 2).

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Рис. 2. Культура Proteus mirabilis, выделенная из фекалий теленка № 313 (агар Плоскирева, +37°, 24 ч)

Микроорганизмы рода Staphylococcus spp. на МПБ после 48 ч инкубирования образовывали помутнение и слизистый осадок на дне пробирки, на плотных питательных средах – круглые гладкие блестящие колонии желтого или белого цвета (рис. 3)

Рис. 3. Культура Staphylococcus spp., выделенная из фекалий теленка № 324 (солевой агар, +37°, 24 ч)

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Для определения патогенности выделенных микроорганизмов проводили биопробу на лабораторных животных. На заражение одной культуры использовали три особи (три особи – контроль).

При патолого-анатомическом вскрытии трупов мышей, зараженных культурами E. coli (серовариант О 115), обнаруживали кровоизлияния в подкожной клетчатке и кишечнике, увеличение печени и селезенки, острое расширение сердца, абсцесс в месте введения суспензии и в паренхиматозных органах (печень, легкие, селезенка, почки).

У погибших лабораторных мышей, зараженных культурами Proteus spp., отмечали кровоизлияния в подкожной клетчатке и кишечнике, наличие крови в брюшной полости, увеличение селезенки, единичные абсцессы в кишечнике и почках.

При вскрытии трупов мышей, зараженных культурами Staphylococcus spp., обнаруживали точечные кровоизлияния в подкожной клетчатке, дистрофию почек, серозный спленит, некрозы в селезенке и печени, острое расширение сердца.

Все культуры E. coli и Staphylococcus spp. при посеве на кровяной агар вызывали гемолиз эритроцитов (рис. 4). Изолированные микроорганизмы рода Proteus spp. гемолитической активностью не обладали.

Рис. 4. Культура Escherichia coli , выделена от теленка № 317 β-гемолиз (кровяной агар, +37°, 24 ч)

При определении чувствительности патогенных микроорганизмов, выделенных из проб фекалий, использовали антибактериальные препараты различных фармакологических групп: фторхинолоны (пефлоксацин, ципрофлоксацин, энрофлоксацин и левофлоксацин), аминогликозиды (канамицин, гентамицин, амикацин и стрептомицин), тетрациклины (докси- и тетрациклин), цефолоспорины (цефуроксин и цефалексин), а также макролиды (азитромицин) и пенициллины (амоксиклав).

Установлено, что эффективность в отношении E. coli проявило большинство исследуемых антибиотиков (66,7%). Выявлена высокая активность двух препаратов – амоксициллина и левофлоксацина (табл. 3).

Микроорганизмы рода Proteus spp. обладали менее выраженной чувствительностью к антибактериальным препаратам по сравнению с E. coli, определена 100%-ная устойчивость к доксициклину, пефлоксацину, цефуроксиму и амоксиклаву.

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Такая же тенденция отмечена и у стафилококков, они проявляли резистентность к гентамицину, доксициклину, канамицину, амикацину, стрептомицину и фосфомицину (табл. 3).

Таблица 3

Чувствительность выделенных культур к антибактериальным препаратам

Препарат	E. coli	P. mirabilis	P. vulgaris	Staphylococcus spp.
Гентамицин	13 (–)	0 (–)	20 (+)	0 (–)
Доксициклин	17 (ум.)	0 (–)	0 (–)	0 (–)
Канамицин	16 (ум.)	12 (–)	0 (–)	0 (–)
Пефлоксацин	21 (ум.)	0 (–)	0 (–)	8 (–)
Тетрациклин	0 (–)	11 (–)	9 (–)	26 (+)
Амикацин	20 (+)	16 (ум.)	20 (+)	0 (–)
Ципрофлоксацин	–	17 (ум.)	0 (–)	31 (+)
Стрептомицин	30 (+)	10 (–)	0 (–)	0 (–)
Цефуроксим	30 (+)	0 (–)	0 (–)	4 (–)
Энрофлоксацин	40 (+)	–	–	32
Цефалексин	26 (+)	18 (ум.)	15 (ум.)	14 (ум.)
Азитромицин	13 (+)	–	–	22 (+)
Фосфомицин	12 (–)	17 (+)	0 (–)	0 (–)
Левофлоксацин	40 (+)	16 (ум.)	0 (–)	19 (+)
Амоксиклав	12 (–)	0 (–)	0 (–)	18 (ум.)

Примечание . (+) – культура чувствительна; (–) – культура не чувствительна; (ум.) – умеренная чувствительность

При микробиологическом исследовании проб фекалий от телят опытной и контрольной групп после применения препарата «Гуматэн» установлены изменения как в качественном, так и в количественном составе микрофлоры кишечника (табл. 4).

Таблица 4

Видовые и количественные характеристики состава кишечной микрофлоры молодняка КРС до/после применения препарата, КОЕ/г

№ теленка	Bifidobacterium spp.		Lactobacillus spp.		E. coli		Staphylococcus spp.		Proteus spp.
	до	после	до	после	до	после	до	после	до	после
Опытная группа
318	107	108	106	106	4,9 ∙ 105	5,1 ∙ 106	1 ∙ 103	1 ∙ 103	1 ∙ 104	1 ∙ 102
316	108	108	107	107	2,4 ∙ 107	2,6 ∙ 107	–	–	1 ∙ 103	1 ∙ 102
324	106	108	106	106	1,8 ∙ 106	2,6 ∙ 106	>1 ∙ 105	1 ∙ 102	–	–
23320	106	106	106	107	1,4 ∙ 105	2,1 ∙ 106	1 ∙ 102	1 ∙ 102	1 ∙ 103	1 ∙ 102
317	109	108	107	107	1,4 ∙ 108	1,8 ∙ 108	–	–	–	–
Контрольная группа
313	108	108	106	106	1,3 ∙ 106	1,8 ∙ 106	>1 ∙ 105	1 ∙ 105	1 ∙ 104	1 ∙ 105
21316	106	108	106	106	4,8 ∙ 104	4,5 ∙ 104	1 ∙ 103	1 ∙ 103	1 ∙ 103	1 ∙ 105
21329	108	108	106	106	5,7 ∙ 106	5,7 ∙ 106	1 ∙ 103	1 ∙ 103	1 ∙ 103	1 ∙ 102
333	106	108	107	107	5,1 ∙ 105	5,1 ∙ 105	–	–	1 ∙ 103	1 ∙ 102
21328	109	109	107	107	4,3 ∙ 106	4,6 ∙ 106	–	–	–	1 ∙ 102

При проведении количественной оценки разных видов микроорганизмов, выделяемых с фекалиями, мы наблюдали, что резидентная микрофлора в кишечнике телят представлена бифидо-, лактобактериями, а факультативная – непатогенными штаммами кишечной палочки, условно патогенными энтеробактериями, сапрофитными стафилококками и протеем.

Vestnik Omsk SAU, 2022, no. 1(45)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Препарат «Гуматэн» (опытная группа) после курса выпаивания не повлиял на количество полезных бактерий ( Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp.) кишечника телят в целом, их количество осталось на прежнем уровне.

Известно, что бифидо- и лактобактерии являются двумя основными бактериями, населяющими кишечник, которые оказывают определяющее влияние на формирование иммунной системы. Бифидобактерии, активно размножаясь и колонизируя поверхность слизистой кишечника, создают биопленку, препятствуя прикреплению и размножению условно патогенных и патогенных бактерий. Антагонистическая активность бифидобактерий связана с образованием лактата, ацетата, лизоцимоподобных и других веществ с антибактериальной активностью. Они способны подавлять токсинообразование и разрушать токсины патогенных бактерий и кормов. Лактобактерии выполняют функцию катализатора в физиологических процессах, происходящих в кишечнике. Важная функция лактобацилл – это синтезирование протеолитических ферментов, которые расщепляют углеводы, белки и жиры. Обусловлена антагонистическая активность лактобактерий синтезом органических кислот и бактериоцинов, которые фиксируются на рецепторах возбудителей, изменяя структуру и проницаемость клеточной стенки бактерий, вызывая ее лизис.

При выпаивании препарата у всех опытных животных отмечено повышение количества штаммов непатогенной Escherichia coli . Непатогенные штаммы кишечной палочки, являясь обычными обитателями кишечника, приносят пользу организму хозяина, например, синтезируя витамин K, а также предотвращая развитие патогенных микроорганизмов.

В контрольной группе изменений в количественном составе Escherichia coli не наблюдали, минимальное содержание – 4,5 ∙ 10⁴ КОЕ/г, при нормативных показателях 1 ∙ 10⁶–1 ∙ 10⁷ КОЕ/г, у одного теленка была выделена патогенная культура Escherichia coli О41.

Количество условно патогенной микрофлоры, а именно Staphylococcus spp ., осталось без существенных изменений в ректальных смывах телят всех групп.

У телят опытной группы количество микроорганизмов рода Proteus в ректальных смывах снизилось в 10–20 раз у 60% (3 гол), а у 40% телят (2 гол) микроорганизмы не были обнаружены. У всех животных контрольной группы увеличилось содержание этих микроорганизмов до максимального – 1 ∙ 10⁵ КОЕ/г.

Заключение

Таким образом, после курса выпаивания препарата «Гуматэн» оказано положительное влияние на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта телят. Его применение привело к уменьшению количества условно патогенных микроорганизмов и отсутствию энтеропатогенных Escherichia coli .