Динамика патоморфологических изменений в ишемизированном спинном мозге крыс после лечения рекомбинантным эритропоэтином (экспериментальное исследование)

Введение. Сосудистые заболевания спинного мозга встречаются намного чаще, чем об этом было принято думать. По современным статистическим данным соотношение частоты сосудистых заболеваний головного и спинного мозга равно 4:1.

Спинальный инсульт - это нарушение спинального кровообращения с повреждением спинного мозга и расстройством его функций вследствие затруднения или прекращения поступления крови.

В результате повреждающего действия ишемии происходят необратимые изменения нейронов – формируется очаговый некроз, образуется зона инфарктного ядра [4]. В течение нескольких часов центральный «точечный» инфаркт окружен ишемизированной, но живой тканью – так называемой зоной «ишемической полутени», или пенумбры [2]. В области пенумбры, в целом, сохранен энергетический метаболизм и присутствуют лишь функциональные, но не структурные изменения [9]. Это область «критической», или «нищей» перфузии, где нейрональная функция снижена, потому что не обеспечиваются метаболические запросы ткани, но клетки остаются жизнеспособными с сохранным ионным гомеостазом. Именно при своевременном и правильном медикаментозном воздействии на зону пенумбры удается сохранить нейроны от разрушения.

Поэтому в настоящее время большое количество исследований направлено на поиск новых методов лечения спинального инсульта. В связи с этим, в последние годы большой интерес вызывает рекомбинантный эритропоэтин (РЭП) – препарат с доказанной протек-тивной активностью в ответ на ишемию в различных органах и тканях, включая головной [8] и спинной мозг [5]. Показано, что РЭП обладает антиапоптотическим и антигипокси-ческим действием, стимулирует ангио- и ней- рогенез [3, 7, 8, 10], а плейотропные эффекты РЭП реализуются за счёт наличия специфических рецепторов на различных клетках, в том числе на нейронах [6].

Материалы и методы исследования. Нами проведён эксперимент на 40 беспородных половозрелых крысах разного пола массой 220–250 г. Все животные были разделены на 2 серии опытов.

1-я серия эксперимента. На 20 животных (группа сравнения) моделировали ишемию спинного мозга по методике, предложенной Г.З. Суфиановой и др. [1]. Транзитор-ную ишемию поясничного отдела спинного мозга создавали тотальной интравазальной окклюзией брюшной аорты и ее ветвей. С этой целью в обе бедренные артерии по направлению к сердцу вводили окклюдеры (стерильную нить из хромированного кетгута 3.0), глубину введения которых определяли расстоянием от мечевидного отростка до основания хвоста. Через 45 мин окклюдеры извлекали, а бедренные артерии затем клипировали. Животных выводили из опыта на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

2-я серия эксперимента. На 20 животных моделировали ишемию спинного мозга по методике, описанной выше (2-я серия эксперимента). Через три часа после операции каждому животному вводили внутрибрюшинно 1000 МЕ рекомбинантного эритропоэтина (ЭПОКРИН 2000 МЕ) из расчёта 5000 МЕ на 1 кг массы тела животного. Затем введение препарата повторяли через 24 и 48 ч по 1000 МЕ после создания ишемии. Выведение животных из опыта осуществляли на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

После выведения животных из эксперимента готовились гистологические препараты срезов спинного мозга, которые окрашивались гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии, по методу Бильшовского для выявления миелиновых волокон, по методу Ниссля для верификации тигроидного вещества Ниссля. Исследование и фотографирование микропрепаратов проводилось на микроскопе Leica DMRXA (Германия).

Для объективизации параметров морфологических изменений использовали следующие счётные признаки: 1) количество неизменённых (нормальных) нейронов на условной единице площади; 2) количество нейронов с хроматолизом на условной единице площади; 3) количество клеток-теней на условной единице площади; 4) количество мелких кровеносных сосудов (капилляров, артериол) на условной единице площади.

Морфометрические исследования проводили с помощью компьютерной программы анализа цветового изображения «ДиаМорф Cito-W» (Россия), при увеличении микроскопа × 400, в 10 случайно отобранных полях зрения.

Полученные результаты обрабатывали на IBM PC с помощью лицензионного пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoftIns, США). Применялись методы вариационной статистики. Статистическая значимость различий сравниваемых признаков в группах оценивалось с использованием непараметрического U-теста Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне P < 0,05, что соответствует 95 % вероятности безошибочного прогноза.

Результаты исследования и их обсуждение. При гистологическом исследовании препаратов поясничного утолщения спинного мозга первой серии эксперимента, наиболее выраженные изменения отмечались в передних рогах – хроматолиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глыбок базофильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени. Встречались также неизмененные и гиперхромные нейроны. Отмечалась нейронофагия, перицеллюлярный и периваскулярный отек в белом веществе. На 7-е сут в центральной зоне ишемического очага определялись деструктивные изменения в нейронах, а в перифокальной зоне отмечались также неповрежденные нейроны. Увеличивалось содержание астроцитов с признаками их гипертрофии, наблюдалась активизация микроглии, появлялись макрофаги. К 14-м и 30-м сут эксперимента морфологические изменения в тканях спинного мозга были сходными с таковыми, описанными на 7-е сут. В то же время в зоне ишемии сформировался глиосоединительнотканный рубец.

Результаты количественного исследования препаратов спинного мозга в первой серии эксперимента показали, что число нормальных нейронов (24,3 ± 1,1) было значительно меньше лишь на 7-е сут, а количество нейронов с хроматолизом существенно увеличивалось, начиная с 7-х сут (36,4 ± 0,9) до конца сроков эксперимента. В свою очередь, количество клеток-теней также увеличивалось, но достоверно только на 7-е сут (58,1 ± 2,5), а число кровеносных сосудов – на 30-е сут (10,2 ± 0,6) наблюдения (см. таблицу).

При исследовании гистологических препаратов спинного мозга второй серии эксперимента на 3-е и 7-е сут опытов, а также в последующие сроки наблюдения (14-е и 30-е сут) отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди которых встречались отдельные гиперхромные клетки и лишь единичные были с признаками набухания и сморщивания. Определялась гиперемия, активная пролиферация эндотелиоцитов капилляров и артериол. Отсутствия глиосоединительных рубцов на всех сроках опытов свидетельствовало о слабо выраженных ишемических повреждениях, без формирования зоны некроза в тканях спинного мозга.

Результаты морфометрического анализа гистологических препаратов спинного мозга второй серии эксперимента показали, что со- держание нормальных нейронов по сравнению с предыдущим сроком опыта увеличивалось незначительно, за исключением 7-х сут (81,8 ± 2,8), а число нейронов с хроматолизом на 7-е сут (20,1 ± 0,8), 14-е сут (17,1 ± 0,5), 30-е сут (12,2 ± 0,3) существенно уменьшалось. Наряду с этим, число клеток-теней достоверно уменьшалось: 10,1 ± 0,2 (7-е сут); 8,3 ± 0,4 (14-е сут); 3,8 ± 0,5 (30-е сут). Количество мелких кровеносных сосудов было значительно больше на 7-е сут (11,9 ± 0,2) и 30-е сут (17,3 ± 0,3). Кроме того, содержание нормальных нейронов кровеносных сосудов было достоверно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше на всех сроках наблюдения по сравнению с 1-й серией опыта (см. таблицу).

Таким образом, у всех животных с ишемией спинного мозга, леченных рекомбинантным эритропоэтином, при исследовании гистологических препаратов спинного мозга на 3-и и 7-е сут опыта, а также в последую-

Динамика количественных изменений исследованных показателей в ишемизированных тканях спинного мозга крыс различных серий опытов (М ± m)

Dynamics of quantitative changes in the examined parameters in ischemic spinal cord tissues in rats of different experimental series (М ± m)

Примечание: 1-я серия опыта – модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта – модель ишемии спинного мозга, леченная РЭП; * – p < 0,05 по сравнению с предыдущим сроком опыта в каждой серии; ** – p < 0,05 по отношению к 1-й серии опыта.

Note: the 1^st experimental series is spinal cord ischemia model (control group); the 2^nd experimental series is spinal cord ischemia model, treatment with REP; * – p < 0.05 in comparison with the previous stage of experiment for each experimental series; ** – p < 0.05 in comparison with the 1^st experimental series.

щие сроки наблюдения (14-е и 30-е сут) отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди которых встречались отдельные гиперхром-ные клетки и лишь единичные были с признаками набухания и сморщивания. Наряду с этим, число клеток-теней уменьшалось, причем на 7-е сут достоверно, по сравнению с 3-ми сут. Количество кровеносных сосудов значительно увеличивалось на 7-е и 14-е сут опытов. Кроме того, число нейронов с хроматолизом и клеток-теней было меньше на всех сроках экспериментов по сравнению с животными контрольной группы.

Заключение. На модели ишемии поясничного отдела спинного мозга, вызванной у крыс тотальной интравазальной окклюзией брюшной аорты и ее ветвей, выявлено нейро-протекторное и ангиогенное действие рекомбинантного эритропоэтина, проявлявшееся существенным увеличением толерантности нейронов к повреждению увеличением числа мелких кровеносных сосудов в зоне ишемии.