Динамика показателей оксидативного статуса у кроликов (Oryctolagus cuniculus L.) при моделировании технологического стресса и его фармакологической коррекции

Стресс входит в число наиболее значимых факторов, нарушающих гомеостаз у животных и человека. Под воздействием стресс-реакции изменяется баланс биологически активных веществ, что приводит к развитию патологий. Многие отечественные и зарубежные ученые сходятся в том, что дисбаланс антиоксидантных и прооксидантных процессов — одно из первых проявлений нарушения обмена веществ под воздействием стресса (1-4). Проблема стресса в животноводстве стоит крайне остро: стресс приводит к уменьшению продуктивности, снижению качества продукции, росту заболеваемости животных, уменьшению темпов воспроизводства и, как следствие, рентабельности животноводства (5-7). Благополучие животных (animal welfare) важно не только в контексте гуманизации хозяйственной деятельности человека, но и с точки зрения экономической выгоды, и потому привлекает внимание исследователей и практиков.

К сожалению, приходится констатировать, что в животноводстве технологический стресс сопутствует практически всем этапам производственного процесса. Он возникает во время транспортировки животных, при выполнении операций по кормлению и уходу, может наблюдаться при резких сменах рационов и условий содержания, на его развитие может повлиять изменение условий микроклимата и многие другие факторы (8-10). Помимо технологического стресса у животных возникает физиологический стресс, обусловленный наиболее напряженными периодами их эксплуатации, таких, например, как беременность и роды (11, 12).

В норме свободнорадикальное окисление обеспечивает нормальное функционирование клетки и осуществление в ней обменных процессов (13, 14). При патологическом изменении этих процессов запускается механизм цепного поражения клеток и тканей из-за способности свободных радикалов нарушать структуру и целостность биологических мембран (1517). Интенсификация свободнорадикальных реакций, выходящих из-под контроля системы антиоксидантной защиты, — наиболее вероятный механизм поражения организма при стрессовой нагрузке (18, 19).

В настоящее время животноводство ориентировано на повышение благополучия поголовья. Однако из-за того, что объемы продукции необходимо увеличивать при минимальных затратах, не всегда удается изменять технологии таким образом, чтобы уменьшить количество стресс-факторов и силу их воздействия (20). Следовательно, сохраняется целесообразность фармакологической профилактики нарушений, вызываемых стрессом. Механизм действия современных средств и методов коррекции изменений, обусловленных негативным воздействием стресс-факторов на организм, должен быть эффективным и безопасным (21, 22).

В настоящей работе на основании оценки состояния системы антиоксидантной защиты, кортизолового и тироксинового статуса при моделировании технологического стресса мы впервые показали антистрессовый эффект разработанных антиоксидантных и антистрессовых препаратов.

Нашей целью было изучение влияния экспериментально смоделированной стресс-реакции на динамику показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты у кроликов на фоне коррекции комплексными антиоксидантными и антистрессовыми препаратами.

Методика . По принципу аналогов сформировали 6 групп кроликов ( Oryctolagus cuniculus L.) породы советская шиншилла (возраст 6-7 мес, по 20 животных в группе). Технологический стресс моделировали, помещая подопытных животных в специально изготовленные модули площадью 0,12 м² на 5 сут (иммобилизация с ограничением пространства). Кроликам из II группы внутримышечно вводили препарат для коррекции стрессовых состояний у сельскохозяйственных животных (антистрессовый препарат) (23) в дозе 3,9 мг/кг живой массы (по действующему веществу) за 3 сут и за 1 ч до иммобилизации, по аналогичной схеме в III группе применяли препарат Мебисел (24) в дозе 6,0 мг/кг, в IV группе — антиоксидантный препарат для животных (25) в дозе 5,4 мг/кг, а в V группе — Полиоксидол в дозе 5,0 мг/кг (26). В I группе препаратов не применяли (эти кролики служили контролем). Все использованные препараты разработаны на кафедре терапии и фармакологии Ставропольского ГАУ. Испытуемые препараты, которые использовали во II и III группах, содержат действующие вещества с антистрессовым эффектом, примененные в IV и V группах — обладают антиоксидантным действием.

При обработке данных рассчитывали средние ( M ) и стандартные ошибки средних ( ± SEM). Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты. Известно, что иммобилизация с ограничением пространства — один из наиболее сильных стресс-факторов (28-31). Анализ данных, полученных при лабораторном исследовании крови, указывает на то, что иммобилизационный стресс, смоделированный у кроликов в лабораторных условиях, приводит к многократному повышению количества кортизола и снижению продукции тироксина (табл. 1). Установлено, что у животных, которых не подвергали профилактической обработке, концентрация кортизола в крови за 1 сут нахождения в ограниченном пространстве возросла в 5,8 раза и оставалась высокой в течение всего эксперимента. Необходимо отметить, что в крови особей, которым перед провокацией стрессовой реакции вводили антистрессовые и антиоксидантные препараты, также зафиксировали значительное повышение уровня кортизола и пик такого увеличения приходился на 1-е сут воздействия стресс-фактора. Но при этом даже на пике этот показатель был меньше, чем в контроле: во II группе — на 65,2 %, в III — на 44,7 %, в IV — на 22,9 % и в V — на 29,5 %, причем разница между группами на этом и последующих этапах эксперимента носила статистически достоверный характер (p ≤ 0,05). После прекращения воздействия стресс-фактора тенденция к нормализации количества кортизола в крови была более выражена у животных, которых проходили фармакологическую подготовку. Через 5 сут после завершения иммобилизации у кроликов из I группы зафиксировали самые высокие значения по этому параметру (они превышали показатели в остальных группах в 1,8 раза и более).

Нами установлено, что применение антистрессовых и антиоксидантных препаратов способствовало увеличению количества тироксина в крови кроликов (см. табл. 1). Через 3 сут после введения препаратов концентрация этого гормона у животных во II группе возросла на 42,3 %, в III группе — на 48,6 %, в IV и V группах — соответственно на 9,1 и 31,1 %. После перемещения кроликов в ограниченное пространство количество тироксина во всех группах снизилось, причем в большинстве из них более чем на 50 %. В пробах крови, полученных через 5 сут после завершения иммобилизации, концентрация гормона увеличилась во всех группах. В контроле этот показатель был статистически достоверно меньше: относительно II группы — на 64,6 % (p ≤ 0,01), III — на 82,7 % (p ≤ 0,01), IV и V — соответственно на 37,7 (p ≤ 0,01) и 27,2% (p ≤ 0,02). Динамика содержания тироксина свидетельствует о том, что стресс-реакция оказывает выраженное тормозящее влияние на его выработку, а применяемые препараты имеют значимый профилактический эффект.

• 1.    Концентрация гормонов стресса и продуктов перекисного окисления липидов в крови кроликов (Oryctolagus cuniculus L.) породы советская шиншилла при моделировании стресса иммобилизации (M±SEM, n = 20)

  Группа	Кортизол, нмоль/л	Тироксин, нмоль/л	Диеновые конъюгаты, ед. OD/мг липидов	Малоновый диальдегид, мкмоль/л	Основания Шиффа, отн. ед/мл сыворотки
  I	38,26±2,69	До введения препаратов 27,18±1,94             0,33±0,03		1,29±0,09	0,30±0,02
  II	34,67±2,12	29,43±2,15	0,29±0,02	1,17±0,08	0,27±0,02
  III	37,19±2,74	26,83±1,71	0,34±0,03	1,31±0,09	0,30±0,03
  IV	35,72±2,44	33,62±1,98	0,31±0,02	1,24±0,08	0,31±0,02
  V	39,12±2,81	28,52±2,03	0,34±0,03	1,32±0,09	0,28±0,02
  I	40,73±2,56	Перед и 25,44±1,58	ммобилизацией 0,34±0,03	1,32±0,09	0,31±0,02
  II	22,21±1,70a	42,27±2,99a	0,27±0,02	1,19±0,08	0,27±0,02
  III	24,96±1,94a	39,87±3,11a	0,30±0,02	1,28±0,09	0,31±0,02
  IV	36,09±2,48 e	36,70±2,78a	0,24±0,02c	1,20±0,09	0,29±0,02
  V	38,47±2,61 e	37,39±2,63a	0,21±0,02d	1,23±0,08	0,26±0,02
  I	Чер 238,23±16,89	е з 1 сут п о с л е 13,47±1,00	начала иммобилизации 0,62±0,05         1,57±0,11		0,35±0,03
  II	144,19±11,17a	20,53±1,46a	0,46±0,04a	1,48±0,10	0,31±0,02
  III	131,74±9,75a	23,66±1,59a	0,42±0,03a	1,43±0,09	0,33±0,03
  IV	183,51±13,90d	17,32±1,34c	0,37±0,03a	1,25±0,08a	0,27±0,02a
  V	167,91±12,07c	19,48±1,48a	0,33±0,02d	1,22±0,08b	0,26±0,02a
  I	Чер 1 181,14±12,93	е з 5 сут п о с л е 9,93±0,72	начала иммобилизации 0,87±0,07        2,01±0,15		0,67±0,05
  II	74,60±5,21a	16,58±1,26a	0,62±0,05a	1,73±0,13	0,56±0,04
  III	86,89±6,34a	18,21±1,33a	0,58±0,04a	1,59±0,11a	0,52±0,04a
  IV	111,24±7,72d	12,97±0,93d	0,41±0,03d	1,41±0,10a	0,48±0,04a
  V	100,76±7,14b	13,22±1,18c	0,45±0,03d	1,36±0,10b	0,41±0,03b
  	Через	5 сут п о с л е з а в е р ш е ния и мм о б ил из ац ии
  I	149,12±11,65	11,84±0,89	0,59±0,04	1,88±0,14	0,72±0,05
  II	48,57±3,65a	19,49±1,39a	0,43±0,03a	1,49±0,10a	0,59±0,04a
  III	60,08±4,62a	21,63±1,70a	0,39±0,03a	1,42±0,10a	0,46±0,03b
  IV	81,24±5,76d	15,06±1,12d	0,36±0,03a	1,31±0,09a	0,39±0,03b
  V	76,43±5,53d	16,31±1,21c	0,32±0,02b	1,28±0,09a	0,33±0,03d
  П р и м еч а ни е. а — между этой и I группой разница статистически значима; b —					между этой, I и II
  группами разница статистически значима; с —			между этой, I и III группами разница статистически зна-
  чима; d —	между этой, I, II и III группами разница статистически значима; e — между этой II и III груп-
  пами разница статистически		значима (p ≤ 0,05)	.

• 2.    Показатели системы антиоксидантной защиты крови и динамика живой массы кроликов ( Oryctolagus cuniculus L.) породы Советская шиншилла при моделировании стресса иммобилизации ( M ±SEM, n = 20)

  Группа	ГПО, мкмоль G-SH/(л•мин•103)	СОД, ед. акт/мг гемоглобина	Каталаза, мкмоль Н 2 О 2 /(л•мин•103)	Глутатион восстановленный, ммоль/л	Живая масса, кг
  I	7,39±0,53	До введени 4,72±0,36	я препаратов 24,13±1,78	0,31±0,02	3,58±0,26
  II	8,43±0,64	5,11±0,42	23,27±1,51	0,35±0,03	3,44±0,23
  III	7,87±0,57	4,93±0,39	23,79±1,82	0,33±0,03	3,61±0,29
  IV	8,18±0,69	5,02±0,46	24,42±1,96	0,34±0,03	3,49±0,24
  V	7,34±0,56	4,81±0,34	22,94±1,35	0,29±0,02	3,70±0,31
  I	7,22±0,36	Перед имм 4,64±0,39	обилизацией 24,05±1,66	0,30±0,02	3,64±0,30
  II	10,31±0,76a	5,63±0,58	23,89±1,47	0,35±0,03	3,42±0,28
  III	11,13±0,69a	5,49±0,43	24,01±1,59	0,35±0,03	3,65±0,32
  IV	12,41±0,88a	6,18±0,53a	26,95±1,91	0,37±0,03	3,57±0,29
  V	12,93±0,82b	5,92±0,55	27,11±2,13	0,32±0,03	3,72±0,34
  I	Через 1 5,07±0,42	сут п о с л е н а ч а л а и м м о б и л и з 3,22±0,25              19,47±1,28		ации 0,26±0,02	3,37±0,21
  II	10,56±0,71a	5,41±0,44a	21,60±1,43	0,30±0,02	3,31±0,29
  III	13,22±0,94b	5,78±0,50a	22,11±1,52	0,32±0,02a	3,48±0,27
  IV	14,49±1,09b	5,89±0,52a	24,76±1,73a	0,35±0,03a	3,34±0,31
  V	15,01±1,03b	6,14±0,57a	25,31±1,80a	0,30±0,02	3,51±0,33
  I	Через 5 4,68±0,34	сут п о с л е н а ч а л а и м м о б и л и з 2,95±0,23              14,53±1,12		ации 0,20±0,02	3,09±0,24
  II	9,69±0,67a	4,26±0,29a	16,82±1,20	0,27±0,02a	3,24±0,27

  III IV V I II III IV V	10,92±0,83a 12,45±0,88b 12,95±0,96b Через 6,33±0,51 9,38±0,59a 11,19±0,82a 12,86±0,89b 13,13±0,97b	4,71±0,33a             18,63±1,36a 5,04±0,40a             21,26±1,49b 5,63±0,44b             23,15±1,42c 5 сут п о с л е з а в е р ш е ния и м м < 3,41±0,27              18,49±1,54 4,47±0,32a             20,88±1,41 5,23±0,41a             24,31±1,89a 5,79±0,38b             26,52±2,33b 6,34±0,52b             25,91±2,07a	Продолжение таблицы 2 0,30±0,02a       3,51±0,32 0,32±0,02a       3,22±0,25 0,34±0,03a       3,45±0,29 обилизации 0,23±0,02        3,21±0,28 0,31±0,02a       3,38±0,31 0,34±0,03a       3,68±0,32 0,36±0,03a       3,40±0,26 0,37±0,03a       3,64±0,32
  П р и м еч а ни е. ГПО — глутатионпероксидаза, СОД — супероксиддисмутаза. a — между этой и I группой разница статистически значима; b — между этой, I и II группами разница статистически значима; c — между этой, II и III группами разница статистически значима (p ≤ 0,05).

Установлено, что воздействие стресс-фактора сопровождается интенсификацией перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует изменение концентрации продуктов пероксидации. Концентрация диено-770

вых конъюгатов в контрольной группе за 5 сут иммобилизации увеличилась в 2,5 раза. В условиях 5-суточной иммобилизации у животных из II группы, которые получили антистрессовый препарат, показатель возрос на 82,3 %, у кроликов, которым назначали Мебисел, — на 93,3 %, в IV группе, где использовали еще один антиоксидантный препарат, — на 70,8 %, а в V группе, в которой вводили Полиоксидол, произошло более чем 2-кратное увеличение. После завершения иммобилизации концентрация диеновых конъюгатов уменьшалась во всех пяти группах, но в контрольной группе этот показатель был достоверно (p ≤ 0,05) выше, чем в опытных.

Сравнивая значения для малонового диальдегида между группами, стоит отметить, что на протяжении всего эксперимента самое высокое содержание этого продукта пероксидации было у контрольных особей. В пробах крови, полученных через 5 сут после завершения иммобилизации, концентрация малонового диальдегида в I группе была на 20,7 % (p = 0,16) выше, чем во II, на 24,5 % (p ≤ 0,05) выше, чем в III, на 30,3 (p ≤ 0,05) и 31,9 % (p ≤ 0,05), выше, чем соответственно в IV и V группах (см. табл. 1).

Динамика накопления флуоресцирующих оснований Шиффа в крови животных из всех групп практически не изменялась по истечении 3 сут с момента введения препаратов. Через 1 сут после начала моделирования стрессового воздействия стали проявляться различия. За 5 сут иммобилизации концентрация оснований Шиффа в I группе была на 16,4 % выше, чем во II ((p = 0,09), на 22,4 % выше, чем в III (p = 0,02), на 28,4 % выше, чем в IV (p ≤ 0,01), и на 38,8 % выше, чем в V группе (p ≤ 0,01) (см. табл. 1).

Оценивая динамику показателей ферментативного звена системы антиоксидантной защиты, отметим, что применение антиоксидантных и антистрессовых препаратов привело к повышению активности ферментов (табл. 2). По завершении эксперимента активность глутатионпероксидазы в первой I группе была на 48,2 % меньше, чем во второй (p ≤ 0,01), на 76,8 % (p ≤ 0,01) — чем в III, в 2,0 и 2,1 раза — чем в IV и V. Такую разницу можно объяснить тем, что в состав действующего вещества всех примененных препаратов входит селенсодержащее соединение.

Активность супероксиддисмутазы ощутимо возросла в крови животных, которые получали антиоксидантные и антистрессовые препараты, при снижении этого показателя в контроле. Смоделированный технологический стресс приводил к выраженному уменьшению активности суперок-сиддисмутазы в крови кроликов из I (контрольной) группы. За 5 сут иммобилизации статистически достоверная разница между I и II группой составила 44,4 % (p ≤ 0,01), I и III — 59,6 %, I и IV — 70,8 % (p ≤ 0,01), I и V — 90,8 % (p ≤ 0,01).

После того как кроликов возвратили в привычные для них условия содержания, у них нормализовалась активностиь каталазы, но в контрольной группе этот показатель был значительно ниже, чем в остальных: разница со II группой составила 12,9 % (p = 0,25), с III — 31,5 % (p ≤ 0,02), с IV — 43,4 % (p ≤ 0,01) и с V — 40,1 % (p ≤ 0,01) (см. табл. 2).

Глутатион — один из важных факторов антиоксидантной защиты (32, 33) и критических маркеров оценки ее функционирования (34, 35). После 5-суточной иммобилизации кроликов концентрация восстановленного глутатиона в I группе была на 35 % ниже, чем во II (p ≤ 0,02), на 50 % (p ≤ 0,01) — по сравнению с III, на 60 % (p ≤ 0,01) и 70 % (p ≤ 0,01) — соответственно с IV и V группами (см. табл. 2).

Воздействие смоделированного технологического стресса отрицательно повлияло на динамику живой массы кроликов. Применение антиоксидантных и антистрессовых препаратов ускорило постстрессовую адаптацию, что выразилось в увеличении среднесуточного прироста массы тела животных. За 5 сут, прошедших с момента прекращения ограничения подвижности, у кроликов из I группы среднесуточный прирост массы составил 24,2 г, во II — 28,4 г, в III — 34,1 г, в IV — 35,6 г и в V — 38,3 г.

Таким образом, мы установили, что развивающаяся стресс-реакция проявляется резким увеличением количества кортизола в крови — до 238,23±16,89 нмоль/л, при этом максимальных значений показатель достигает в 1-е сут воздействия стресс-фактора. Исходя из этого, можно считать, что 1-е сут наиболее критические для течения патологического процесса при иммобилизационном стрессе у животных. Также при технологическом стрессе на протяжении всего периода его воздействия наблюдается снижение концентрации тироксина — с 27,18±1,94 до 9,93±0,72 нмоль/л. Смоделированный стресс отразился на функционировании системы антиоксидантной защиты, что проявилось уменьшением активности ферментов глутатионпероксидазы на 36,7 %, супероксиддисмутазы на 37,9 % и каталазы на 39,8%, а также снижением концентрации восстановленного глутатиона на 35,9 %. Депрессивное состояние антиоксидантной системы сопровождается значительным накоплением в крови продуктов перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид и флуоресциру- ющие основания Шиффа). Негативное воздействие стресса на организм кроликов также выражается в уменьшении живой массы на 490 г за 5 сут иммобилизации.

Применение четырех разработанных нами антистресовых препаратов для профилактики негативных последствий технологического стресса способствует стабилизации уровня кортизола, тироксина, активности антиоксидантных ферментов и концентрации продуктов перекисного окисления липидов. При этом транквилизаторы в большей степени снижают концентрацию кортизола и нормализуют количество тироксина, что способствует улучшению показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты. Антиоксидантные препараты активизируют функцию ферментативного звена антиоксидантной защиты и снижают накопление продуктов перекисного окисления липидов в организме кроликов, в результате чего уменьшается количество тироксина и кортизола. Это позволяет рекомендовать разработанные средства для фармакологической профилактики технологического стресса.

Итак, установлено, что при экспериментальном воспроизведении стресс-реакции (иммобилизация) у кроликов развивается окислительный стресс, который выражается в возрастании концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови: диеновых конъюгатов, малонового диальдегида и флуоресцирующих оснований Шиффа, а также в уменьшении активности глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы на фоне увеличения концентрации кортизола и снижения — тироксина. Применение новых лекарственных средств для животных — препарата для коррекции стрессовых состояний у сельскохозяйственных животных, антиоксидантного препарата для животных, Мебисела и Полиоксидола эффективно профилактирует технологический стресса и может быть использовано в практической ветеринарии. Нормализация антиоксидантного статуса у кроликов приводит к уменьшению уровня кортизола и повышению концентрации тироксина в крови. С учетом результатов выполненного нами исследования можно рекомендовать включение препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в схемы профилактики технологического стресса у животных.