Динамика показателей тромбоцитов, лейкоцитов и функциональной активности эндотелия у молодых крыс линии shr

Гипертония является фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Осложнения АГ являются причиной 9,4 млн смертельных случаев в мире ежегодно [1].

Механизмы, лежащие в основе патогенеза этого заболевания, остаются неясными, несмотря на наличие множества гипотез. Существуют многочисленные данные о том, что АГ сопровождается эндотелиальной дисфункцией и активацией лейкоцитов и тромбоцитов [3, 5, 10, 11]. Некоторые авторы оценивают данные изменения как системную слабо выраженную воспалительную реакцию [7, 8, 16]. Однако остается неясным, является ли воспалительная реакция патогенетическим фактором развития АГ или следствием системного повышения АД. Одним из подходов в решении данного вопроса может быть изучение динамики ряда гематологических показателей и функциональной активности эндотелия в период роста АД.

Цель работы: изучить динамику состава, количественных показателей и морфологических параметров лейкоцитов и тромбоцитов и вазодилататорной функции эндотелия у молодых крыс SHR до и в ранний период формирования у них АГ.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 40 крысах самцах линии SHR (spontaneously hypertensive rats) и 40 крысах самцах линии Wistar-Kyoto (WKY) категории SPF, полученных из вивария ИБХ РАН, г. Пущино (сертификат здоровья животных от 04.09.2014). В виварии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга животные содержались в неполной барьерной системе при следующих параметрах окружающей среды: температура - +22±2 ° С, относительная влажность – 50±20%, воздухообмен – 12–15 объемов помещения в час, световой режим – 12:12 ч. Содержание животных и уход за ними осуществлялись в соответствии с правилами, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Протокол исследования утвержден комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол № 72052014). Животные каждой линии были разделены по возрасту на 8 возрастных групп, соответствующих 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 неделям жизни, по 5 крыс в каждой группе.

АД у крыс регистрировали неинвазивным методом на хвосте с помощью системы измерения АД у мелких животных NIBP200A (“BiopacSystems, Inc.”, США). Запись и обработка данных производилась на компьютере с помощью программы “AcqKnowledge 4.2 for MP150”.

Общее количество лейкоцитов 109/л крови и относительное количество лимфоцитов, моноцитов, гранулоци- тов, общее количество тромбоцитов (PLT, 109/л крови), средний объем тромбоцитов (MPV, fl), показатель анизоцитоза тромбоцитов (PDW) и тромбокрит (PCT) определяли с помощью автоматического гематологического анализатора “Mythicvet 18” (PZ CORMAY S.A.). Кровь забирали из насечек на хвосте в капиллярные пробирки “MicrovetteSarstedt” (Германия) с K3EDTA.

Функциональную активность эндотелия оценивали по эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. Под наркозом (диэтиловый эфир) катетеризовали общую сонную артерию и регистрировали АД датчиком TSD 104A на аппаратном комплексе для электрофизиологических исследований MP150 (“BiopacSystems, Inc”, США). Непрерывную запись АД и последующую обработку данных производили на компьютере с помощью программы “AcqKnowledge 4.2 for MP150”. Функциональное состояние эндотелия оценивали по значению индекса вазодилатационной активности (ИВА), который рассчитывали как отношение площади над кривой снижения АД в ответ на внутривенное введение эндотелийзависимого вазодилататора ацетилхолина (5 мкг/кг) к площади над кривой снижения АД в ответ на внутривенную инъекцию эндотелийнезависимого вазодилататора натрия нитропруссида (30 мкг/кг).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ “Statistica 8.0”. Данные представлены в виде M±m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрические критерии Краскела–Уоллиса и Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

АД у крыс линии WKY в период с 5-й по 12-ю неделю оставалось стабильным: среднее значение систолического артериального давления (САД) в эти сроки жизни составляло 125±2 мм рт. ст., диастолического артериального давления (ДАД) – 95±2 мм рт. ст. (рис. 1). У крыс линии SHR в возрасте 5 недель АД достоверно не отличалось от значений у нормотензивных крыс линии WKY того же возраста. На 6-й неделе у крыс линии SHR наблюдалось увеличение АД, которое сохранялось до конца исследования.

В течение всего периода наблюдения общее количество лейкоцитов крови у крыс линии SHR статистически значимо не отличалось от значений у крыс линии WKY (табл. 1). Вместе с тем была выявлена динамика изменения относительного количества различных типов лейкоцитов, связанная как с возрастом животных, так и с периодом формирования АГ. На 5-ю неделю жизни доля лимфоцитов у животных линии SHR и крыс линии WKY дос-

Рис. 1. САД (А) и ДАД (В) у нормотензивных крыс линии WKY и спонтанно гипертензивных крыс линии SHR в период с 5-й по 12-ю неделю: * – p<0,05 по сравнению со значениями у крыс линии WKY того же возраста

Таблица 1

Динамика общего количества лейкоцитов (WBC, 109/л крови) и относительного количества лимфоцитов (LYM, %), моноцитов (MON, %) и гранулоцитов (GRA, %) у крыс линий WKY и SHR

Возраст	Группа	WBC	LYM	MON	GRA
5-я неделя	WKY	8,76±1,06	73,64±1,51	5,16±0,50	21,2±1,13
	SHR	9,28±1,98	77,66±3,02	3,98±0,23*	18,36±2,89
6-я неделя	WKY	9,24±1,50	70,11±3,15	8,22±0,61	20,41±2,48
	SHR	8,68±1,28	80,89±0,86*	7,58±1,54	12,92±1,39*
7-я неделя	WKY	6,58±0,34	70,66±2,19	9,68±0,64	19,34±1,11
	SHR	8,82±0,97	78,15±1,30*	5,84±0,43*	13,71±0,56*
8-я неделя	WKY	8,28±0,58	69,51±2,86	10,22±0,44	20,28±2,11
	SHR	6,90±0,79	77,91±1,67*	5,58±0,72*	16,18±1,31
9-я неделя	WKY	6,49±0,58	69,63±1,95	10,84±0,91	20,42±2,71
	SHR	7,29±0,89	79,39±2,84*	6,71±0,63*	14,63±1,57
10-я неделя	WKY	9,26±0,54	73,41±1,54	10,66±0,63	17,13±1,78
	SHR	11,08±1,53	79,39±1,23*	7,52±0,38*	14,49±1,30
11-я неделя	WKY	7,02±0,23	67,85±1,42	10,60±0,50	20,80±3,21
	SHR	7,64±1,35	77,02±1,90*	8,08±0,56	14,49±2,29
12-я неделя	WKY	7,76±0,72	72,77±1,76	10,57±0,84	16,23±1,64
	SHR	8,16±1,31	79,25±1,37*	8,00±0,73	10,90±1,84

Примечание: * – p<0,05 по сравнению со значениями у крыс линии WKY того же возраста.

Таблица 2

Динамика общего количества тромбоцитов (PLT, 109/л крови), тромбокрита (PCT, %), среднего объема тромбоцитов (MPV, fl) и показателя анизоцитоза тромбоцитов (PDW) у крыс линий WKY и SHR

Возраст	Группа	PLT	PCT	MPV	PDW
5-я неделя	WKY	879,0±86,9	0,55±0,10	6,14±0,49	21,36±1,55
	SHR	765,6±81,6	0,50±0,08	6,80±0,29	26,50±2,23
6-я неделя	WKY	934,1±57,6	0,52±0,04	5,60±0,29	20,33±0,91
	SHR	960,7±37,7	0,54±0,02	5,64±0,07	24,56±0,90*
7-я неделя	WKY	1058,8±70,8	0,57±0,04	6,99±0,36	16,85±1,00
	SHR	894,8±73,5	0,56±0,03	5,85±0,07	28,22±2,14*
8-я неделя	WKY	885,2±33,9	0,54±0,04	6,01±0,24	19,01±1,02
	SHR	823,9±39,9	0,46±0,02	5,67±0,15	26,59±1,41*
9-я неделя	WKY	815,5±24,26	0,44±0,01	5,38±0,10	23,38±0,58
	SHR	645,3±30,93*	0,38±0,02	6,02±0,08*	36,39±2,10*
10-я неделя	WKY	844,1±65,6	0,43±0,03	5,09±0,05	25,92±1,14
	SHR	726,0±54,1	0,38±0,05	5,81±0,17*	36,16±2,00*
11-я неделя	WKY	861,7±62,1	0,43±0,03	4,98±0,03	25,35±0,86
	SHR	757,2±54,4	0,42±0,03	5,63±0,07*	36,72±1,68*
12-я неделя	WKY	763,5±42,8	0,41±0,02	5,25±0,11	25,89±2,11
	SHR	618,8±83,7	0,38±0,05	6,12±0,19*	36,96±2,84*

Примечание: * – p<0,05 по сравнению со значениями у крыс линии WKY того же возраста.

товерно не отличалась. Начиная с 6-й недели и до конца всего периода исследования доля лимфоцитов у линии SHR была достоверно выше, чем у крыс линии WKY на 6,48–10,78% (p ≤ 0,05). Относительное количество моноцитов у крыс линий SHR и WKY на 5-й неделе жизни было ниже, чем в остальные сроки исследования, что может быть связано с возрастными особенностями животных. В период с 11-й по 12-ю недели достоверных различий относительного количества моноцитов не было выявлено. На 6 и 7-й неделях жизни обнаружено снижение доли гранулоцитов у линии SHR относительно данного показателя у крыс линии WKY.

Общее количество тромбоцитов в течение всего периода наблюдения крови у крыс линии SHR статистически значимо не отличалось от значений у крыс линии WKY за исключением 9-й недели (табл. 2). Тромбокрит у животных линии SHR достоверно не отличался от значений у крыс WKY в течение всего периода исследования. На 5-ю неделю жизни PDW у животных линии SHR и крыс линии WKY достоверно не отличался. Начиная с 6-й недели и до конца всего периода исследования, наблюдалось статистически значимое увеличение PDW на 21–67% у животных линии SHR по сравнению со значениями у крыс WKY. У крыс линии SHR MPV в период с 5-й по 8-ю недели жизни достоверно не отличался от значений у нормотензивных животных. С 9-й по 12-ю недели жизни было выявлено статистически значимое увеличение MPV у крыс линии SHR на 12–17% по сравнению с крысами линии WKY.

Значения ИВА у крыс линий SHR и WKY в возрасте 5, 6 и 7 недель достоверно не различались. Однако у крыс линий SHR, начиная с 8-й недели и в последующие периоды наблюдения, ИВА был достоверно ниже на 14–26% по сравнению со значениями этого показателя у крыс линии WKY (табл. 3). Снижение ИВА эндотелия происходит за счет уменьшения сосудорасширяющей реакции на внутривенное введение эндотелийзависимого вазодила- татора ацетилхолина. Данный факт свидетельствует о выраженной эндотелиальной дисфункции у животных линии SHR, которая формируется, начиная с 8-й недели жизни.

Полученные результаты позволили выявить последовательность нарушений функций лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелия в процессе формирования АГ. АГ у крыс линии SHR начинает формироваться в возрасте 6 недель. Одновременно с повышением АД у крыс линии SHR наблюдалось увеличение относительного количества лимфоцитов по сравнению с крысами линии WKY. Также в возрасте 6 недель происходило повышение показателя анизоцитоза тромбоцитов у крыс линии SHR относительно данного показателя у животных линии WKY. Повышение показателя анизоцитоза тромбоцитов свидетельствует об усилении их функциональной активности. E. Vagdatli и соавт. [14] связывают увеличение степени анизоцитоза тромбоцитов у пациентов, имеющих достоверно высокую агрегацию тромбоцитов, с образованием у активированных клеток псевдоподий и изменением их размеров. К 8-й неделе жизни у крыс линии SHR наблюдалось формирование эндотелиальной дисфункции, которая проявлялась в снижении индекса вазодилататорной активности эндотелия у спонтанно гипертензивных животных по сравнению с крысами линии WKY. На 9-й неделе жизни у крыс линии SHR наблюдалось увеличение среднего объема тромбоцитов. Повышение среднего объема тромбоцитов свидетельствует о наличии в кровотоке крупных тромбоцитов, которые по сравнению с более мелкими содержат больше гранул и активнее агрегируют [4, 9, 14].

Возможно, повышение количества лимфоцитов и активация тромбоцитов могут вносить вклад в развитие эндотелиальной дисфункции у крыс линии SHR. Имеются данные о том, что при разрушении лимфоцитов выделяются активные формы кислорода и ангиотензин II [6]. Кроме того, лимфоциты, проникая в адвентицию сосудов, продуцируют TNF α , IFN γ , способствуя экспрессии молекул адгезии на эндотелии [13]. Активированные тромбоциты продуцируют широкий спектр воспалительных медиаторов, оказывающих значимые местные и системные эффекты [2, 12].

Таким образом, в результате проведенного исследования было выявлено, что у крыс линии SHR с началом

Таблица 3

Динамика индекса вазодилататорной активности (усл. ед.) у крыс линий WKY и SHR

Возраст крыс	WKY	SHR
5-я неделя	0,52±0,05	0,48±0,10
6-я неделя	0,47±0,002	0,44±0,06
7-я неделя	0,52±0,04	0,47±0,03
8-я неделя	0,48±0,03	0,41±0,05*
9-я неделя	0,40±0,03	0,31±0,03*
10-я неделя	0,43±0,04	0,32±0,05*
11-я неделя	0,40±004	0,33±0,03*
12-я неделя	0,42±0,02	0,31±0,02*

Примечание: * – р<0,05 по сравнению со значениями у крыс линии WKY того же возраста.

повышения АД происходят изменения количественного состава лейкоцитов и морфологических параметров тромбоцитов, после чего происходит нарушение вазоди-лататорной функции эндотелия.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (соглашение № 14-25-00017).