Динамика уровня противовоспалительных цитокинов и их роль в развитии полимодальных локальных эффектов при прогрессировании рака яичников

При злокачественном росте с цитокинами взаимодействует две системы: неоплазма – цитокины и иммунная система – цитокины [3]. При этом опухолевые клетки могут как экспрессировать соответствующие рецепторы, так и продуцировать цитокины.IL-1 является медиатором как местного так и дистантного действия на разные ткани и обладает широким спектром биологической активности. В опухолевом процессе большую роль играет IL-1 Р . Фактор некроза опухоли (TNF- а ) получил название по основному биологическому эффекту-лизису опухолевых клеток. Точка зрения о безусловном противоопухолевом влиянии TNF- а с середины 90-х годов была опровергнута убедительными дока-

зательствами участия этого цитокина в канцерог-незе и опухолевой прогрессии. Продуцировать TNF- а способны многие опухолевые клетки, в том числе и клетки рака яичников (РЯ). При росте опухоли уровень содержания TNF- а в крови может повышаться как за счет его продукции опухолевыми клетками, так и в результате усиленного выделения макрофагами [8]. Интерфероны (IFN) представляют одну из самых быстро реагирующих систем иммунологической защиты. Точный механизм их противоопухолевого действия не известен. Предполагается прямое и непрямое противоопухолевое действие IFN [9].

Цель исследования – изучить динамику изменений уровня цитокинов (TNF- a , IFN- У , IL-1 Р ) и их роль в развитии полимодальных локальных и дистантных эффектов при прогрессирующих формах рака яичников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследуемая группа состояла из 83 первичных больных РЯ, находящихся на I-IV клинической стадии заболевания (по FIGO). Контрольную группу составили 40 женщин-доноров. Концентрацию TNF- а , IFN- У иIL-1 Р в сыворотке крови измеряли методом ИФА. Срезы, полученные из блоков биопсийного материала, окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, по Малори, альциановым синим. Квантиметрию составляющих опухоли осуществляли в 10 произвольных полях зрения на микроскопе “ReichztPolivar 2” с планообъективом FJAPO 10х0,30, совмещенным с цифровой видео- камерой JVC разрешением 800х600 пикселей. При оценке экспрессии mtp53, bcl-2, Ki-67 и PCNA использовали моноклональные антитела фирм Novocastra и Dako. Статистическую обработку данных проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни и коэффициента корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено существенное и достоверное повышение уровня IL-1 Р , IFN- Y и TNF- а у больных РЯ по сравнению со здоровыми (табл. 1).

Из данных табл.1 следует, что уровниIL-1 Р , TNF- а и IFN- Y статистически значимо повышены по сравнению с контролем уже на I-ой клинической стадии заболевания и продолжали повышаться на II-IV стадии заболевания. Наблюдаемые изменения уровня TNF- а и IFN- Y обнаруживали прямую положительную корреляцию со стадией заболевания (r=0,700 и r=0,120 соответственно).

Источником данных провоспалительных цитокинов, видимо, могут быть как сами опухолевые клетки, так и клетки-эффекторы, круг которых расширяется по мере прогрессирования опухоли, так как организм все в большей степени использует воспалительный тип ответа на новообразование [5]. Кроме того, прирост концентрации, в частности TNF- а , может обеспечиваться, по мнению ряда авторов [2], двумя аддитивными механизмами: селекцией клеток, резистентных к цитотоксическому действию TNF- а и тем, что экспрессируемые опухолевыми клетками антигены также индуцируют повышенную продукцию TNF- а . При этом ограничение чувствительности рецепторов опухолевых клеток к регуляторным молекулам также предопределяет прирост концентрации цитокинов и их выраженное побочное влияние на рецепторы нормальных клеток.

Провоспалительные цитокины, и в частности, IL-1 и TNF- а , обладают системным действием. Так, IL-1, способен проникать через гематоэнцефалический барьер и стимулировать в па-равентрикулярном ядре гипоталамуса секрецию кортикотропинвысвобождающего фактора, который повышает в аденогипофизе выработку АКТГ. Последний инициирует в коре надпочечников выброс глюкокортикоидов [1]. Это ведет к усилению действия факторов стресса на все системы. TNF- а также инициирует активность эндокринных желез, что приводит к увеличению уровня АКТГ, гонадотропина и других гуморальных факторов.Результатом системного действия на организм TNF-а и IL-1 является развитие продромального синдрома, проявляющегося снижением аппетита, сонливостью, лихорадкой, повышением болевой чувствительности.

Иммунная толерантность малигнизированных клеток появляется на мембранном, цитоплазматическом и генетическом уровнях. Клеточная мембрана, цитоплазма и ядро опухолевой клетки защищают ее от эффекторов иммунной системы. При этом к возможностям самой раковой клетки добавляются защитные механизмы микроокружения. Например, инфильтрацию неоплазмы клетками иммунной системы и активность эффекторных молекул ограничивают фибриновый и слизистый барьеры. Непосредственные контакты раковых и стромальных клеток могут приводить и к активной пролиферации фибробластов в пограничной зоне, что особенно заметно в некоторых образцах серозных и муцинозных опухолей яичников (рис. 1).

В этих условиях соединительнотканные клетки, ориентируясь длинной осью параллельно линии паренхима – строма, выстраивают плотный пограничный вал. При этом фибробласты тесно прилегают кдруг другу и одновременно контактируют с раковыми клетками на пограничной линии. Здесь чаще встречаются молодые и средние формы фибробластов, реже обнаруживаются большие типы фибробластов и фиброциты (рис. 2). Фибриновые волокна всегда присутствуют в опухолевой ткани и это особенно характерно для зоны активной пролиферации неоплазмы. Мощный фибриновый барьер образуется в результате стимуляции фибриногенеза исопутствующегофибринолиза. Опухолевые клетки при этом активируют компоненты свертывающей системы и образование фибрина че-

Таблица 1. Уровень цитокинов у больных РЯ на различных клинических стадиях заболевания

Группы Показатели	контроль	I стадия	II стадия	III стадия	IV стадия
	N=48	N=12	N=12	N=40	N=40
IL-1β	36,8±10,74	216,7±49,35*	236,7±24,99*	248,5±9,00*	230,9±15,04*
TNF-α	31,0±2,82	55,0±9,53*	64,4±13,38*`	104,8±9,90*`	93,8±9,96*`
IFN-γ	44,0±7,67	95,8±9,49*	107,1±8,76*	120,9±10,33*`	114,4±15,17*

Примечание: данные статистически значимо отличаются от аналогичных:

*- в контроле; ‘- от соответствующих показателей на предыдущей клинической стадии заболевания.

Рис. 2. Фиброциты дегенерирующие, РЯ (окраска гематоксилин-эозином, микрофото. Х1200)

Рис. 1. Фибробласты стромы серозного РЯ, располагающиеся вблизи зоны инвазии раковых клеток в строму

(окраска гематоксилин-эозином, микрофото. Х600) рез присутствующие в зоне опухоли макрофаги. Последние, под влиянием неоплазмы, усиливают продукцию провоспалительных цитокинов IL-1, TNF- a , которые индуцируют на эндотелии и активированных макрофагах экспрессию тканевого фактора свертывания крови. Неоплазма использует фибриновую сетку в качестве преграды для клеток иммунной системы. Кроме того, фибрин повышает устойчивость малигнизированных клеток к химиотерапии. Фибрин также необходим для роста малигнизированных клеток. Его нити формируют тракт для перемещения этих клеток в структуре ткани и защищают их от цитотоксических эффекторов иммунной системы. Кроме того, раковые клетки потребляют фибрин, используя его в качестве основного трофического материала [6]. Нити фибрина стимулируют фибробласты, которые поддерживают в опухоли концентрацию ростовых факторов и секретируют компоненты стромы опухолевой ткани. Кроме того, в структуре опухоли фибрин выполняет функцию внеклеточного матрикса. Неоплазма использует фибрин, благодаря своей способности контролировать систему плазмин-тканевые ингибиторы-активаторы плазминогена. Процесс образования ингибитора активатора плазминогена в зоне малигнизации при этом инициируется провоспалительными цитокинами [7].

Для усиления биологического потенциала неоплазмы и поддержания ее роста и развития одним из наиболее значимых представляются такие эффекты IL-1 и TNF- a , как образование denovo сосудов в зоне опухолевого роста, расширение и нарушение проницаемости этих сосудов, стимуляция пролиферации и блокирование апоптоза опухолевых клеток. При изучении параметров сосудистого русла первичной опухоли при раке яичников на различных клинических стадиях заболевания нами было установлено, что в процессе опухолевой прогрессии имеется тенденция к возрастанию объема и плотности сосудов на 1 мм² опухоли (табл. 2).

Как следует из рис. 3 (А, Б) это соответствует возрастанию содержания в крови провоспали-тельных цитокинов IL-1 и TNF- a . Следует, однако, отметить, что данный процесс происходит на фоне возрастающих концентраций IFN- / , который ингибирует ангиогенез в опухоли. Возможно, именно этот фактор определяет то, что возрастание объема и плотности сосудов в опухоли не были статистически значимы.

Также было показано, что основную массу сосудов микроциркуляторного русла первичных раковых опухолей яичников составляют капилляры с диаметром более 10 мкм и с дефектами эндотелиальной выстилки (рис. 4).

Таблица 2. Параметры сосудистого русла первичной опухоли при раке яичников на различных клинических стадиях заболевания

Показатели Стадия РЯ	Объем сосудов, %					Сосуды на 1 мм2 опухоли
	М	m	к.в.	Макс.	Мин.	М	m	к.в.	Макс.	Мин.
I-II, n=33	3,81	0,88	0,48	10,7	1,2	20,4	4,71	0,35	59,1	10,2
III, n=40	4,06	0,45	0,51	11,4	1,6	22,71	2,17	0,34	61,3	11,8
IV, n=33	4,66	0,48	0,46	12,8	2,9	24,43	2,74	0,38	63,2	13,1

Примечание: различие показателей по стадиям статистически не значимо (р>0,05)

А

Рис. 3. (А, Б). Изменение параметров сосудистого русла первичной опухоли и содержания провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF- а и IFN-г) в крови при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

Б

Рис. 4. Синусный сосуд с дефектом эндотелиальной выстилки (окраска гематоксилин-эозином, микрофото. Х600)

Селективное давление со стороны нормоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины (TNF- а , IL-1) может привести к образованию дефектных антионкогенов и их неактивных РНК-продуктов. К их числу относится белок р-53 – один из индукторов апоптоза и ген Bcl-2, продукт которого обладает цитопротекторной активностью [4].

По поводу судьбы р53 – ключевого внутриклеточного белка – супрессора злокачественной трансформации клетки – на сегодня существует несколько точек зрения. Согласно мнения одних авторов, при злокачественной трансформации низкий уровень р53 связан с ускоренной деградацией этого белка. В результате ограничиваются возможности реализации апоптотических сигналов по р53-зави-симому пути. Согласно другой точки зрения [10], в малигнизированных клетках имеют место мутации гена р53, связанные с усиленной экспрессией мРНК отдельных цитокинов. С другой стороны, наличие мутантной формы гена р53 рассматривают как фон, необходимый для развития дисрегуляции цитокинов связь между экспрессией мутантного гена р53 и цитокинами прослеживается при исследовании РЯ. Так, в результате проведенных нами исследований установлено (рис. 5) возрастание процентного содержания атипических эпителиальных клеток яичника, экспрессирующих р53, в динамике раковой прогрессии. Увеличение р53⁺ клеток яичника коррелировало с экспрессией IL-1 Р и TNF-

Рис. 5. Динамика процентного содержания атипических эпителиальных клеток яичника, экспрессирующих p53 (-) и Bcl-2 (- · -) на различных клинических стадиях заболевания

a . Корреляционные связи на различных стадиях заболевания: средняя (r=-0,6618) и сильная (r=0,8407) соответственно.

Проапоптотическая активность цитокинов, в частности IFN-г, может быть преодолена в условиях избытка белка с-myc, уровень которого низок в нормальных клетках и высок в опухолевы-х.Развитие апоптоза при действии цитокинов на опухолевые клетки требует мобилизации про-апоптотических факторов митохондрий. Устойчивая компартментализация этих факторов обеспечивается белками семейства Bcl-2, часть из которых индуцируют апоптоз, другая – обладает антиапоптотической активностью. При этом в выживающих малигнизированных клетках экспрессируются антиапоптотические белки этого семейства, но ограничена экспрессия проапопто-генных форм [11]. Белки семейства Bcl-2 необ- ходимы для блокирования митохондриальных пор для проапоптотических факторов.

Результаты наших исследований свидетельствуют об увеличении клеток РЯ, экспрессирующих Bcl-2, при прогрессировании опухоли (корреляция со стадией заболевания положительная высокая, r=0,6255).

К наиболее значимым для усиления потенциала опухоли и поддержания ее роста и развития эффектам цитокинов с системными эффектами (TNF- а и IL-1) относится их способность стимулировать пролиферацию опухолевых клеток. Нами установлено увеличение пролиферативной активности и митотического индекса в неоплазме при прогрессировании РЯ (рис. 6).

Значимая корреляция показателей PCNA, Ki-67 и митотического индекса с уровнем провоспа-лительных цитокинов представлена в табл. 3.

PCNA        Ki-67       митотический инд ек с

Рис. 6. Пролиферативная активность и митотический индекс раковых клеток первичного опухолевого узла при прогрессировании РЯ

Таблица 3. Корреляционные связи уровня провоспалительных цитокинов (IL-1 Р , IFN- У и TNF- а ) с показателями пролиферативной активности, апоптоза и параметрами микроциркуляторного русла при прогрессировании РЯ

Показатель	I стадия РЯ			II стадия РЯ			III стадия РЯ			IV стадия РЯ
	IL- 1 р	TNF- а	IFN- У	IL- 1 Р	TNF- а	IFN- У	IL- 1 Р	TNF- а	IFN- У	IL- 1 Р	TNF- а	IFN- У
Ki-67	-	-0,95	-	0,40	-0,44	-	-	-	-	0,39	-	-
PCNA	0,80	-0,40	0,60	-0,43	-	-	-	-	-	-	-0,35	-
Митотич. индекс	1,00	-0,80	0,80	0,46	-0,92	-0,43	-	-	-	0,44	-	-
Об.сосудов, %	0,05	-0,24	-0,60	0,05	-0,24	-0,60	0,14	0,21	0,14	0,06	-0,08	0,07
Сосуды на 1мм2 опухоли	-	-	-0,32	-	-	-0,32	-	-	-	-	-	-
р53	-	0,60	0,40	-0,67	-0,84	-0,58	-	-0,40	-	-	-	-
Bcl-2	0,40	-0,80	-	-	-0,70	-	-	-	-	-	-	-

Таким образом, в процессе прогрессирования неоплазма интегрируется в основные гомеостатические процессы макроорганизма благодаря использованию региональных и системных функций цитокинов. При этом из всего спектра цитокинов, в том числе и секретируемых опухолью, ключевая роль принадлежит цитокинам с системными эффектами - IL-1, TNF- а и IFN- / .

Наиболее значимыми для усиления биологического потенциала опухоли являются такие эффекты этих цитокинов, как стимулирование пролиферации опухолевых клеток, образование сосудов в зоне опухолевого роста.

Работа поддержана грантом ФЦП “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009-2013гг. и Гос. заданием Министерства образования и науки Российской Федерации.