Дисбаланс состава лимфоцитов и цитокинового профиля как фактор риска развития вибрационной болезни

Боклаженко Елена Валерьевна – кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммуно-биохимических и молекулярно-генетических исследований в гигиене (e-mail: ; тел.: 8 (908) 650-24-29; ORCID: .

Бодиенкова Галина Михайловна – доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией иммуно-биохимических и молекулярно-генетических исследований в гигиене (e-mail: ; тел.: 8 (904) 144-68-49; ORCID: .

1 Пальцев М.А., Кветной М.И. Руководство по нейроиммуноэндокринологии. – М.: Медицина, 2008. – 512 с.

вой системы, которое чаще всего происходит при интенсивных воспалительных реакциях, формируя риск утяжеления болезни [6, 7]. Аккумулируясь в очаге воспаления, интерлейкины и интерфероны воздействуют на большинство клеток, участвующих в этой реакции. К этим клеткам относятся гранулоциты, макрофаги, Т- и В-лимфоциты, а также фибробласты, эндотелиоциты, клетки эпителия [8–10].

Изучение механизмов, лежащих в основе согласованной работы иммунной и нервной систем организма, может являться основой для разработки критериев риска развития ВБ.

Цель исследования – оценить изменения баланса и соотношения фенотипического состава лимфоцитов и цитокинов как факторов риска развития вибрационной болезни.

Материалы и методы. В исследование включены 54 мужчины с диагнозом ВБ, индуцированной локальной вибрацией и сочетанным воздействием общей и локальной вибрации. Диагноз ВБ установлен врачами-профпатологами на базе клиники института (ФГБНУ ВСИМЭИ) в соответствии с международной классификации болезней 10-го пересмотра. Средний возраст пациентов – 51,45 ± 0,87 г., средний стаж работы – 25,5 ± 2,13 г. Основные профессии в данной группе представлены сборщиками-клепальщиками, слесарями-сборщиками, слесарями механосборочных работ, машинистами бульдозеров, машинистами лесовозов, крановщиками, водителями погрузчиков, трактористами. Группа сравнения, сопоставимая по полу и возрасту (51,06 ± 0,95 г.), состояла из 27 практически здоровых лиц, которые в своей профессиональной деятельности не подвергались воздействию вибрации. Критериями включения в исследование для пациентов с ВБ являлись: верифицированный диагноз ВБ у обследованных, письменное информированное согласие на участие в исследовании, стаж работы с вибрацией больше 10 лет.

Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в пробирку с гепарином (для выделения лейковзвеси) и пробирку с активатором свертывания (для получения сыворотки). Количественное определение лимфоцитов и их субпопуляций в условиях in vitro осуществлялось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, специфичных к дифференцировочным антигенам (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD9⁺, CD16⁺, CD20⁺, CD21⁺, CD23⁺, CD25⁺, CD95⁺) («Клоноспектр», г. Москва). Подсчет относительного количества CD-позитивных клеток от общего числа лимфоцитов проводился на микроскопе Olimpus CX-41 (Япония). Определение сывороточных цитокинов IL-2,

IL-4, IL-8, INF-γ выполнялось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем («Вектор-Бест», г. Новосибирск). Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Для сравнения выборок использовали непараметрический U -критерий Манна – Уитни. Описание выборки представлено с помощью медианы и интерквартильного размаха ( Ме ( Q 25– Q 75)). Для выявления взаимосвязи между признаками использовали корреляционный анализ Спирмена. Критический уровень значимости ( p ) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Исследование соответствует этическим стандартам Хельсинкской декларации (2000)² и приказу № 200н Минздрава РФ от 01.04.2016³.

Результаты и их обсуждение. В ранее выполненной нами работе при анализе субпопуляционного состава лимфоцитов у этих же пациентов с ВБ были выявлены изменения иммунного ответа, характеризующиеся возрастанием количества CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-лимфоцитов и снижением CD20⁺, CD25⁺-лим-фоцитов в группе пациентов с ВБ от воздействия локальной вибрации и возрастанием количества CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-, CD16⁺-, CD20⁺-, CD25⁺-, CD95⁺-лим-фоцитов в группе лиц с ВБ от сочетанного воздействия локальной и общей вибрации, что свидетельствует о выраженной активации иммунной системы при этой профессиональной патологии [11]. Учитывая, что субпопуляции лимфоцитов являются продуцентами цитокинов [6, 12], мы проанализировали уровни цитокинов, которые являются отражением активности лимфоцитарных клеток.

При анализе содержания цитокинов у пациентов с ВБ (табл.1) установлено статистически значимое увеличение уровней провоспалительных цитокинов IL-8 и INF-γ при сопоставлении с группой сравнения ( р = 0,007 и р = 0,016 соответственно). Что касается содержания регуляторного IL-2, то у обследованных наблюдалось его снижение, в отличие от группы сравнения ( р = 0,0003).

Приведенные в таблице интерлейкины и интерфероны образуют сеть взаимодействий, в которой они обладают перекрещивающимися функциями и могут оказывать синергическую активность в комплексе с другими цитокинами и лимфоцитами [13]. Поэтому следующим этапом наших исследований являлся корреляционный анализ между фенотипическим составом лимфоцитов и уровнем цитокинов у обследуемых. Выявлены различия в характере корреляций у пациентов с ВБ, которые могут быть связаны с риском утяжеления вибрационной болезни. Что характерно, все указанные взаимосвязи положительные.

Таблица 1

Содержание сывороточных цитокинов у пациентов с вибрационной болезнью, Me ( Q 25– Q 75)

Показатель, пг/мл	Пациенты с ВБ, n = 54	Группа сравнения, n = 27	p
IL-2	4,16 (1,97–7,55)	6,01 (5,68–8,32)	0,0003
IL-4	0,01 (0,01–2,71)	0,01 (0,01–0,32)	–
IL-8	15,84 (0,94–37,38)	10,3 (0,01–14,6)	0,007
INF-γ	1,63 (0,01–38,96)	0,23 (0,01–9,49)	0,016

П р и м е ч а н и е : p – уровень статистической значимости различий.

Таблица 2

Показатели корреляционного анализа между количеством лимфоцитов и цитокинами у пациентов с вибрационной болезнью и группы сравнения

Корреляционные пары лимфоциты – цитокины	Пациенты с ВБ	Группа сравнения
CD3 + - IL-2	0,459	–
CD4 + — IL-4	0,389	–
CD3 + - INF-y	–	–0,681
CD95 + - INF-y	–	–0,633

П р и м е ч а н и е : представленные значения r (коэффициента ранговой корреляции Спирмена) соответствуют p < 0,05; прочерки означают отсутствие статистически значимых корреляционных связей, p > 0,05.

Так, у лиц с ВБ зарегистрирована положительная взаимосвязь между абсолютным количеством общей популяции лимфоцитов CD3⁺ ( r = 0,46; р = 0,029) и уровнем иммуностимулирующего IL-2 (табл. 2). Также у обследованных пациентов с ВБ наблюдалась позитивная зависимость между количеством Т-лимфоцитов-хелперов CD4⁺ и содержанием IL-4 ( r = 0,39; р = 0,027).

Напротив, при исследовании корреляционных зависимостей между показателями клеточного иммунитета и концентрациями цитокинов у лиц группы сравнения отмечалась отрицательная взаимосвязь IFN-γ с абсолютным количеством CD3⁺ ( r = –0,68; р = 0,029) и CD95⁺-лимфоцитов ( r = –0,68, р = 0,047) (табл. 2). Исходя из отсутствия корреляционных связей между IFN-γ и лимфоцитами в группе пациентов с ВБ, можно заключить, что у них из механизмов иммунной регуляции он полностью исключен.

Главная функция системы цитокинов - обеспечение согласованного действия иммунной и нервной систем в ответ на стресс [14]. Анализ содержания цитокинов у пациентов с ВБ позволил выявить гиперактивацию провоспалительных цитокинов IL-8 и INF-γ. Важно отметить, что одним из свойств IL-8 является способность регуляции быстрой секреции белкового продукта IL-8 за счет его высвобождения из нейтрофильных гранулоцитов (содержащих пер-формированный IL-8), мигрирующих после активации клеток. В свою очередь по принципу положительной обратной связи резкий выброс IL-8 может запустить его синтез этими же клетками и вызвать активацию его функциональных свойств и блокиро- вание апоптоза гранулоцитов [15–17]. Можно предположить, что этот механизм саморегуляции продукции указанного интерлейкина может быть основой поддержания хронического воспаления, обеспечивая его обострение в тканях при ВБ, что, несомненно, обусловливает риск пролонгированного течения болезни. Значительное нарастание уровня INF-γ также связано с хронизацией процесса, при котором происходит усиление его выработки Т-хелперами первого типа [18]. Этим можно объяснить то, что содержание IL-4 у пациентов с ВБ определялось в пределах контрольных значений. Обнаруженные нами повышенные концентрации провоспалитель-ных цитокинов свидетельствуют о высокой активности воспалительного процесса и его проявлениях на системном уровне. Однако уровень IL-2 у обследованных был понижен. Стоит отметить, что у пациентов наблюдалось снижение содержания лимфоцитов СD25+, экспрессирующих рецептор к IL-2 (IL-2R). А сниженное содержание IL-2 в крови не способствует связыванию IL-2 с IL-2R, что нарушает пролиферацию Т-хелперов1. Очевидно, при длительном течении ВБ от воздействия вибрации у пациентов наступает истощение секреции указанного цитокина, что приводит к выраженным нарушениям иммунного ответа.

При анализе взаимосвязей между субпопуляциями лимфоцитов и цитокинами у обследованных зарегистрирована положительная корреляция абсолютного количества CD3+-лимфоцитов с уровнем иммуностимулирующего IL-2. Можно предположить, что понижение концентрации IL-2 в крови у пациентов с ВБ происходит на фоне дисбаланса популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, развивающегося за счет нарушений в дифференцировке и созревании клеток иммунной системы, а также их миграции в зону воспаления. Количество CD4+-лимфоцитов у обследованных пациентов с ВБ ассоциировано с содержанием IL-4, который вырабатывается в основном Th2-лимфоцитами. Кроме того, в процессе синтеза этого интерлейкина задействованы тучные клетки, базофилы, В-лимфоциты. IL-4 индуцирует дифференцировку Т-лимфоцитов в Тh2-клетки, подавляя развитие Th1-лимфоцитов, активирует макрофаги, вызывает пролиферацию активированных зрелых Т-клеток [6, 19], что и проявляется в положительных корреляционных связях концентрации цитокина с количеством Т-хелперов (CD4+). В последующем это может быть связано с разработкой информативных критериев тяжести течения патологического процесса. А у лиц группы сравнения отмечались отрицательные корреляции абсолютного количества CD3+ и CD95+-лимфоцитов с IFN-γ. Это вполне объяснимо, так как CD3+-клетки являются продуцентами IFN-γ, который в то же время активирует CD3+-лимфоциты, а CD95+-клетки способствуют его апоптозу [20, 21].

Изменение характера взаимосвязей субпопуляций лимфоцитов с содержанием цитокинов может быть обусловлено сменой цитокиновых продуцентов, а также снижением чувствительности ответа клеток на цитокины [20, 22], что предрасполагает к риску развития иммунопатологических реакций, играющих важную роль в патогенезе ВБ.

Выводы. Таким образом, реализация риска развития и течения вибрационной болезни ассоциирована в определенной степени с ее патогенетическими особенностями, в основе которых лежит в том числе дис- баланс лимфоцитарных фенотипов и про-, противовоспалительных цитокинов, характеризующийся прямой корреляционной зависимостью между CD3+ и IL-2, CD4+ и IL-4, на фоне активации провоспалительных цитокинов IL-8, INF-γ и снижения IL-2. Полученные данные подтверждают сложные функциональные взаимосвязи в иммунной системе и в будущем позволят обосновать новые биомаркеры в дополнительной диагностике ВБ. С целью сбережения здоровья работающих целесообразно распространять опыт исследований иммунного статуса во время периодических медицинских осмотров, направленных на минимизацию рисков развития профессиональных заболеваний.

Финансирование. Работа выполнена в рамках средств, выделяемых для выполнения государственного задания ФГБНУ ВСИМЭИ.