Дизайн, молекулярный докинг и анализ «структура–свойство» новых производных комбретастатина А-4

           eISSN 2311-2468

EDN:                                  

Злокачественные новообразования остаются одной из ведущих причин смертности во всем мире. Это обусловлено их фундаментальным свойством – неконтролируемой пролиферацией и нарушением регуляции клеточного цикла. Современная стратегия тар-гетной терапии, направленной на специфические молекулярные структуры опухолевых клеток, позволяет достичь избирательного подавления роста новообразований при снижении системной токсичности. Одним из наиболее перспективных направлений таргет-ного подхода является ингибирование полимеризации тубулина – структурного белка, формирующего микротрубочки, которые обеспечивают поддержание клеточной формы, внутриклеточный транспорт и процесс митоза [1].

Нарушение динамической нестабильности микротрубочек приводит к остановке клеточного цикла и индукции апоптоза, что подтверждает тубулин как высоковалидную мишень для противоопухолевых препаратов [2]. К числу классических ингибиторов микротрубочек относятся паклитаксел, винкристин и колхицин, связывающиеся с различными сайтами β -тубулина (таксановым, винка-алкалоидным и колхициновым соответственно). Особый интерес вызывают соединения, взаимодействующие с колхициновым сайтом, поскольку они способны преодолевать множественную лекарственную устойчивость [3].

Целью работы является выявление соединений с высокой аффинностью к колхициновому сайту β -тубулина, представляющих интерес для дальнейшего синтеза и биологической оценки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Одним из наиболее изученных ингибиторов этого типа выступает комбретаста-тин A-4 (CA-4) (1) – природный стильбеноид, выделенный из Combretum caffrum ¹. Связываясь с колхициновым сайтом β -тубулина, соединение (1) индуцирует деполимеризацию микротрубочек, проявляя выраженную антимитотическую и антиваскулярную активность [4]. Простая структура и высокая цитотоксичность обусловили использование (1) как ведущего фармакофора для разработки новых антимитотических соединений. Исследования в области «структура–активность» ( Specific Absorption Rate , SAR ) показали, что для реализации активности критически важны: 3,4,5-триметоксифенильный фрагмент (кольцо A), цис -конфигурация ароматических колец относительно этиленового моста и 3-гидрокси-4-метокси-заместитель в фенильном кольце B [5].

Однако клиническое применение (1) ограничено его низкой биодоступностью, вызванной изомеризацией активной цис -формы в термодинамически стабильную, но малоактивную транс -форму in vivo . Для устранения данного недостатка предложены структурные модификации, включающие замену этиленового моста изостерными циклическими или гетероциклическими фрагментами (триазольными [6], оксазольными [7], изоксазольными [8] и др.), что предотвращает изомеризацию и повышает противоопухолевую активность.

66                                                           Технические науки

Важным инструментом рационального дизайна аналогов CA-4 является молекулярный докинг, позволяющий моделировать пространственную ориентацию лигандов в активном сайте белка, оценивать энергию связывания и выявлять ключевые межмолекулярные взаимодействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное моделирование выполнено для серии аналогов комбретастатина, в которых варьировались: количество и положение гидроксильных и метоксильных заместителей на бензольных или пиридиновых кольцах; природа центрального фрагмента, соединяющего арильные кольца – цис -алкеновая связь, циклопропановое или оксадиа-зольное кольцо.

Исследование направлено на дизайн и молекулярный докинг новых производных CA-4, основанных на стильбазольных структурах — аналогах цис -ресвератрола (2), где этиленовый мост заменён изостерными циклическими фрагментами (3,4) (рисунок 1).

R'=H

R=H (a)

R=2-0H (6)

R=3-0H (в)

R=4-0H (r)

R=2.3-

R=2,4-(OH)2 (e)

R=2.5-(OH)₂(ж)

R=3.4-

R=3.5-

R=2.3,4-(OH)3 (к)

R=3.4,5-(OH)3 (л)

R'=CH3:

R=H (m) R=2-OCH₃(h)

R=3-OCH3 (o)

R=4-OCH3(n)

R=2.3-(OCH3)2 (p)

R=2.4-(OCH₃)₂(c)

R=2.5-(OCH₃)₂(t)

R=3_s4-(OCH₃)₂ (y)

R=3.5-(OCH3)2 (ф)

R=2,3.4-(OCH3)3 (x)

R=3,4,5-(OCH3)3 (Ц)

4а-ц

• Р и с . 1 . Структурные формулы исследуемых соединений F i g . 1 . Structural formulas of the researched compounds

Источник: материалы рисунков и таблиц подготовлены авторами по итогам исследования

Source: the materials of the figures and tables were prepared by the authors based on the results of the study

Все структуры были подготовлены в формате SMILES и конвертированы в трехмерные модели с использованием пакета Schrödinger Suite 2023-4. Расчеты проводились на рабочей станции под управлением операционной системы Windows 11 Pro версии 25Н2 с процессором AMD Ryzen 7 PRO 8845HS, объемом оперативной памяти 16 Гб и графическим ускорителем Radeon 780M Graphics. Геометрия соединений оптимизировалась в модуле LigPrep с учетом протонирования при pH 7,0 ± 0,5 и стандартных параметров силового поля OPLS4.

В процессе подготовки генерировались все возможные стереоизомеры для хиральных центров, стереохимия которых не была явно задана во входных структурах, а также учитывалось образование возможных таутомеров. Молекулярный докинг выполнялся в программном комплексе Glide² (модуль Schrödinger Maestro) [9]. В качестве рецептора использована кристаллографическая структура комплекса тубулина с комбрета-статином A-4 (PDB ID 5LYJ) [10]. Белковая структура была подготовлена с помощью Protein Preparation Wizard (реализовались оптимизация цепей, удаление воды, добавление отсутствующих атомов боковых цепей, минимизация при OPLS4). Минимизация проводилась с критерием сходимости по среднеквадратичному отклонению (Root– Mean–Square Deviation, RMSD) 0,30 Å. Сетка докинга центрировалась по положению исходного лиганда (1) с размером 20×20×20 Å, включающим весь гидрофобный карман β-тубулина. Докинг осуществлялся в режиме жесткого рецептора.

Режимом для докинга был выбран Standard Precision (SP). Для каждой молекулы сохранялось по пять лучших конформеров, ранжированных по суммарному значению GlideScore и DockingScore. В качестве эталонного значения использовались результаты для комбретастатина (1) из того же расчета: GlideScore = - 8,888.

Для выявления зависимостей «структура–свойство» были вычислены простые дескрипторы:

– количество гидроксильных и метоксильных групп;

– наличие C=C-связей между sp²-центрами;

– наличие циклопропановых фрагментов;

– наличие 1,2,5-оксадиазольных колец.

Статистический анализ проводился с использованием Python (библиотеки Pandas, Scikit-learn, Matplotlib). Корреляционный анализ реализовывался с расчетом коэффициента корреляции Пирсона. Полученные p-значения корректировались для учета множественного сравнения с помощью метода Бенджамини-Хохберга (False Discovery Rate, FDR). Перед проведением анализа главных компонентов (Principle Component Analysis, PCA) исходные данные были стандартизированы путем вычитания среднего и масштабирования до единичной дисперсии (StandardScaler). Первые два главных компонента объясняют 81 % (PC1 = 58 %, PC2 = 23 %) общей дисперсии данных. ADME характеристики рассчитывались с использованием ресурса ADMETlab [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В проанализированной серии присутствовали соединения с варьирующимся числом кислородсодержащих заместителей (от 1 до 5). Значения GlideScore находились в диапазоне от - 9,68 до – 8,26 ккал/моль, что сопоставимо и в ряде случаев превосходит результаты для эталонного комбретастатина (- 8,888 ккал/моль). Из 96 рассмотренных соединений 7 молекул продемонстрировали лучшие (более отрицательные) значения GlideScore, чем комбретастатин (табл.1). Это указывает на сохранение и возможное улучшение ключевых взаимодействий в активном сайте при определенных модификациях.

68                                                          Технические науки

Таблица 1. Результаты расчетов

Table 1. Calculation results

Кроме того, для указанных соединений были рассчитаны основные ADME характеристики. Большинство соединений, представленных в таблице 1, имеют умеренную липофильность, среднюю растворимость и среднюю площадь полярной поверхности, что соответствует приемлемым ADME характеристикам для удовлетворительной пероральной биодоступности.

На рисунке 2 представлено расположение в сайте связывания соединений каждого ряда, показавших лучшую аффинность.

Р и с . 2 . Связывание соединений в колхициновом сайте β-тубулина: I – наложение структур 1 (красный), 2ж (оранжевый), 3д (зеленый), 4в (желтый); II – взаимодействия структур в сайте связывания

F i g . 2 . Binding of compounds at the colchicine site of β-tubulin: I – superposition of structures 1 (red), 2ж (orange), 3д (green), 4в (yellow); II – interactions of structures at the binding site

Анализ взаимодействия комбретастатина A-4 и его аналогов с тубулином показал, что все соединения связываются в колхициновом сайте и сохраняют ключевые фармакофорные взаимодействия. При этом для рассматриваемых производных фиксируются дополнительные контакты в форме водородных связей, что может обеспечивать повы- шенную аффинность связывания. Таким образом, аналоги являются эффективными био-изостерными заменами исходного соединения, демонстрируя перспективный профиль взаимодействий для дальнейшей структурной оптимизации в качестве ингибиторов полимеризации тубулина.

Корреляционный анализ выявил взаимосвязь между структурными особенностями молекул и энергией связывания. Полученные результаты согласуются с литературными данными, подчеркивающими критическую важность метокси-групп, особенно в 3,4,5-положениях кольца А, для взаимодействия с колхициновым сайтом. Гидроксильные группы также показали умеренную положительную корреляцию, что говорит об их способности формировать дополнительные водородные связи, однако их избыток может увеличивать полярность молекулы, потенциально ухудшая связывание с преимущественно гидрофобным карманом.

Замена цис-алкенового моста на циклопропановое кольцо не ухудшала энергию связывания. Одно из лучших значений GlideScore (- 9,10 ккал/моль) наблюдалось именно для циклопропанового аналога с двумя гидроксильными группами в орто- и мета-положениях. Это подтверждает возможность использования циклопропана как пространственного биоизостера цис-двойной связи, сохраняющего оптимальную ориентацию арильных колец. Данный подход активно используется для стабилизации биоактивной конформации и улучшения фармакокинетических свойств.

В то же время замена на оксадиазольное звено ухудшала показатели, вероятно, вследствие нарушения планарности системы и дестабилизации взаимодействий с аминокислотными остатками в активном кармане. Тем не менее, некоторые исследования показывают, что правильная функционализация гетероциклических линкеров может компенсировать этот эффект и привести к высокоактивным соединениям.

Наилучшее соединение в серии (2ж) показало GlideScore = - 9,675 ккал/моль, что на 0,787 ккал/моль лучше эталонного комбретастатина. Эта структура сохраняет цис-конфигурацию и содержит по одной гидроксильной группе на каждом арильном кольце, что обеспечивает симметричное взаимодействие с белком. Таким образом, минимальная модификация, не нарушающая геометрию и распределение доноров/акцепторов, может улучшить связывание.

Иерархическая кластеризация (Ward linkage) выделила три устойчивых кластера, различающиеся как по типу мостика, так и по числу донорных групп. Средние значения GlideScore для этих кластеров представлены в таблице 2.

Таблица 2. Средние значения GlideScore по типу мостика, ккал/моль

Table 2. Average GlideScore values by bridge type, kcal/mol

Анализ показал, что сохранение цис-C=C-моста обеспечивает наилучшее пространственное связывание и наивысшую аффинность. Циклопропановый мостик является приемлемой заменой, сохраняя цис-ориентацию с умеренной потерей эффективности связывания. Оксадиазольные производные образуют отдельный кластер с наихудшими показателями, что указывает на необходимость дальнейшей оптимизации их структуры.

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексный анализ методом молекулярного докинга серии новых аналогов комбре-тастатина A-4 позволил выявить ключевые зависимости «структура–аффинность»:

Наличие метоксильных групп отрицательно коррелирует со значением GlideScore, внося основной вклад в аффинность за счет гидрофобных взаимодействий с сайтом связывания.

Гидроксильные группы также демонстрируют благоприятную, хотя и более слабую, отрицательную корреляцию, выступая в роли доноров водородных связей, однако их избыток может быть не оптимальным.

Наилучшие показатели наблюдаются для соединений с цис-C=C-мостиком (GlideScore ≈ – 8,5 ккал/моль), что подчеркивает важность сохранения планарности и π-сопряжения.

Замещение C=C на циклопропановый фрагмент является перспективной стратегией стабилизации цис-конформации и приводит к получению соединений с сопоставимой аффинностью (GlideScore ≈ – 8,2 ккал/моль).

Оксадиазольные аналоги в среднем демонстрируют худшие показатели связывания (GlideScore ≈ – 8,0 ккал/моль) и требуют направленной оптимизации геометрии и заместителей.

Таким образом, стратегия изостерной модификации молекулярного каркаса за счет введения циклопропанового фрагмента является обоснованной и позволяет получить перспективные соединения, не уступающие эталону по энергии связывания. Несколько соединений из исследованной серии, в частности сохраняющие цис-алкеновый мостик и содержащие комбинацию гидрокси- и метокси-заместителей, продемонстрировали значения GlideScore, превосходящие комбретастатин A-4.

Основным ограничением настоящего исследования является узкий выбор предлагаемых модификаций двойной связи, а также предсказательный характер результатов, требующий экспериментальной проверки in vitro. В дальнейшем планируется расширить ряд исследуемых соединений за счет включения других гетероциклических и карбоциклических изостеров, а также провести молекулярно-динамическое моделирование для оценки стабильности комплексов лиганд-белок. Кроме того, перспективным направлением представляется изучение влияния полярности и стерических факторов на проницаемость клеточных мембран и метаболическую стабильность предложенных кандидатов.

Полученные результаты имеют практическую ценность для исследователей, занимающихся разработкой противоопухолевых препаратов таргетного действия. Выявленные закономерности «структура–аффинность» и отобранные соединения-кандидаты могут быть использованы для планирования синтеза новых перспективных ингибиторов тубулина и последующего изучения их биологической активности in vitro и in vivo.