Дизайн системы олигонуклеотидов и оптимизация условий амплификации ECF-генов бактерий рода Salinicola семейства Halomonadaсеае

Осуществлен поиск нуклеотидных последовательностей ect-оперона бактерий сем. Halomonadaceae в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации (США) . Анализ выравненных 33 нуклеотидных последовательностей представителей родов Salinicola, Halomonas, Chromohalobacter, Kushneria, Cobetia и Halotalea позволил обнаружить консервативные области. К ним была разработана система олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагмента ect-оперона, включающего гены: ectA, кодирующий L-2,4-диаминобутир-атацетилтрансферазу, и ectB, детерминирующий L-2,4-диаминобутиратаминотрансферазу. Экспериментально подобраны условия полимеразной цепной реакции и состав ПЦР-смеси для амплификации участка ect-оперона на ДНК матрице бактерий рода Salinicola.

морских солеварнях, морях и океане [Ананьина и др., 2007; Aguilera et al., 2007; Kim et al., 2007; Huo et al., 2013; Raju et al., 2016].

Известно, что для выживания в условиях засоления бактерии поддерживают осмотический баланс, как правило, за счет синтеза de novo «совместимых веществ», основным из которых для эубактерий является эктоин. В настоящее время охарактеризованы генетические и биохимические системы биосинтеза эктоина бактерий родов Chromohalobacter и Halomonas семейства Halomo-nadaceae [Ono et al., 1999; Calderon et al., 2004; Cai et al., 2011; Schwibbert et al., 2011; Pastor et al., 2013], в то время как бактерии рода Salinicola остаются менее изученными [Olsson et al., 2017]. Синтез эктоина начинается реакцией трансаминирования L-аспартат-β-полуальдегида с последующим ацетилированием образующегося диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией Nγ-ацетил-L-2,4-диаминобутирата в эктоин. У бактерий семейства Halomonadaceae ген ect A, кодирующий L-2,4-ДАБацетилтрансферазу, и гены ect B и ect C, детерминирующие L-2,4-ДАБамино-трансферазу и эктоинсинтазу, соответственно, расположены в перечисленной последовательности и организованы в единый оперон ect АBС [Ono et al., 1999; Calderon et al., 2004].

В настоящее время в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) представлены нуклеотидные последовательности ect-оперона четырех штаммов бактерий рода Salinicola, из них типовым штаммом валидно описанного вида является лишь Salinicola socius SMB35T. Таким образом, имеющаяся информация не дает представления о разнообразии ect-генов бактерий рода Salinicola. Ввиду этого представляется актуальным амплификация и последующее определение нуклеотидной последовательности ect-генов типовых штаммов рода Salinicola.

Из литературных источников известны пары вырожденных праймеров для амплификации ect- генов бактерий семейства Halomonadaceae [Kuhlmann, Bremer, 2002; Okamoto et al., 2004; Ананьина, Плотникова, 2011]. Проведенный нами анализ данных праймеров in silico показал, что представленные в базе данных NCBI нуклеотидные последовательности ect -генов бактерий рода Salinicola имеют несовпадения в 3’-области праймеров, что, в свою очередь, может затруднить амплификацию. Отсюда следует очевидная потребность в новой эффективной системе олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования интересующих нас генов.

Целью данной работы явилась разработка и оптимизация системы вырожденных праймеров для амплификации и секвенирования ect-генов у типо- вых штаммов валидных видов рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Объектами исследования были типовые штаммы узаконенных видов S. salarius DSM 1844^T, S. peritrichatus JCM 18795^T, S. acroporae JCM 30412^T, S. halophilus CECT 5903^T, S. socius SMB35^T.

Среды и условия культивирования

Минеральная среда Раймонда (г/л деионизированной воды): NH 4 NO 3 – 2.0, MgSO 4 x7H 2 O – 0.2, KH 2 PO 4 – 2.0, Na 2 HPO 4 – 3, CaCl 2 x6H 2 O – 0.01, Na 2 CO 3 – 0.1, pH – 7.0 [Raymond, 1961].

Агаризованная богатая среда Раймонда следующего состава (г/л среды Раймонда): триптон – 5, дрожжевой экстракт – 2.5, NaCl – 30, агар – 15.

Культивирование бактерий проводили на ага-ризованной богатой среде Раймонда в термостатируемом шкафу ТС-1/80 СПУ (Россия) при температуре 28оС.

Молекулярно-генетические и биоинформационные методы исследования

Геномную ДНК выделяли методом щелочного лизиса целых клеток 1 колонии бактериальной культуры, которую вносили в эппендорф, содержащий 100 мкл 0.05 М раствора NaOH, перемешивали и далее выдерживали 15 мин. при 95 ° С, после этого замораживали при -20 ° С в течение 15 мин. Процедуру последовательного замораживания и оттаивания повторяли 3 раза [Versalovic et al., 1994].

Амплификацию ect -генов на матрице ДНК исследуемых штаммов проводили на приборе С1000 Touch («Bio-Rad», США).

ПЦР выполняли в 25 мкл смеси, состоящей из 1х буфера для Taq -полимеразы («Синтол», Россия), 0.25 мМ дНTФ, 1.5 мМ MgCl 2 , 0.004 мг БСА, 10 пкмоль каждого праймера, 2 ед. акт. Taq- полимеразы («Синтол», Россия) и 20 нг геномной ДНК. Кроме того, была использована ПЦР-смесь того же состава, в которой количество каждого праймера было увеличено до 50 пкмоль.

Процедура ПЦР включала начальную денатурацию при 95°С, которая длилась 5 мин. Далее следовали 30 циклов, состоящих из последовательно повторяющихся шагов: денатурации при 94°С в течение 30 сек., отжига праймеров при температурах 38, 39, 42, 46, 50, 54, 57 или 58°С на протяжении 30 сек., каждый цикл завершала элонгация при 72°С длительностью 1 мин. 20 сек. После 30-го цикла следовала терминальная элонгация при 72°С продолжительностью 5 мин. Условия последующих реакций были теми же, но температура отжига праймеров составляла 50°С.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в 0.5х ТВЕ-буфере в напряжении электрического поля 5.0 V/см в течение 40 мин. ДНК была визуализирована после окрашивания бромистым этидием (0.5 мгк/мл) в проходящем УФ-свете и документирована системой Gel Doc XR («Bio-Rad», США) для преобразования сигналов в цифровые данные. Отображаемая на дисплее электрофореграмма, состояла из пикселей. Каждый пиксель имел координаты X и Y, предоставляющие информацию о горизонтальном и вертикальном положении на электрофореграмме, и значение Z - интенсивность сигнала пикселя. Полученные электрофореграммы обрабатывали с

Секвени ро вание генов проводили с помощью разработанных праймеров, Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v3.1 («Thermo Fisher Scientific», США) на приборе Genetic Analyzer 3500xl («Thermo Fisher Scientific», США), следуя инструкциям фирмы-производителя.

Биоинформационное обеспечение. Публичная база данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) . Пакет программ BioEdit ( edu), позволяющий выравнивать нуклеотидные последовательности. Пакет программ OligoAnalyzer 3.1 для определения термодинамических и структурных характеристик праймеров. Подбор праймеров осуществляли, следуя рекомендациям [Патрушев, 2004; Designing PCR primers and probes decoded-articles/pipet-tips/decoded/2013/10/21/ designing-pcr-primers-and-probes].

Результаты и их обсуждение

Конструирование праймеров

Поиск генетических локусов, кодирующих ферменты синтеза эктоина, осуществляли в геномах умеренных галофильных бактерий сем. Halomonadaceae, депонированных в публичной базе данных NCBI (США). В анализ были включены нуклеотидные последовательности 33 штаммов бактерий представителей родов Halomonas , Chromohalobacter , Cobetia, Kushneria, Halotalea и Salinicola .

С применением пакета программ BioEdit нуклеотидные последовательности генов ect-оперона были выравнены (рис. 1). Далее осуществляли поиск консервативных областей длиной от 16 (минимально допустимая длина праймера) до 20 нуклеотидов, у которых на 3'-конце предполагаемого праймера первые два нуклеотида были одинаковыми для всех последовательностей, а третий нуклеотид имел не более 2 замен. На 5'-конце предполагаемого праймера допускали наличие позиций, имеющих до 4 нуклеотидных замен.

а

б

Рис. 1. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ectA- (а) и ectB-генов (б) представителей родов Halomonas, Chromohalobacter, Cobetia, Kushneria, Halotalea и Salinicola семейства Halomonadaceae:

консервативные нуклеотиды выделены цветом, участки, комплементарные праймерам, ограничены линиями и стрелками, указывающими направление амплификации

Было обнаружено две области, соответствующие перечисленным параметрам: позиции 253— 269 ect А-гена и позиции 880—895 ect В - гена согласно нумерации Chromohalobacter salexigens DSM 3043^T (AJ011103) (рис. 1). Принимая во внимание в выбранных регионах вариабельные нуклеотидные позиции, были сконструированы         следующие         праймеры:

EAh 5' GGITTYGTITCIGGYTA 3'            и

EBh 5' CICGRAAIGTRCCGTT 3'. Пара праймеров имела допустимую разницу в содержании ГЦ-пар (до 6%). Отличие между минимальными и максимальными значениями температур плавления праймеров составило 3.4 и 2.1оС, соответственно. Праймеры не образовывали тугоплавких шпилек со свободной энергией Гиббса менее -3 ккал•моль-1. Однако были выявлены гомо- и гетеродимеры, образующиеся за счет спаривания от 2 до 5 нуклеотидов, характеризующиеся ΔG более -9 ккал•моль-1. Биохимические, термодинамические и структурные характеристики подобранных праймеров представлены в таблице.

Характеристика праймеров

Параметр	EAh	EBh
Длина, п.н.	17	16
Степень вырожденности*	4	4
Содержание ГЦ, %	50	56.2
Температура плавления, оС мин. - макс. (средняя)	42.2—57.6 (50.1)	45.6—59.7 (52.5)
Тугоплавкие шпильки ΔG < -3 ккал • моль-1	-	-
Количество гомодимеров, мин. – макс. значение ΔG (ккал • моль-1), в скобках указано количество спаренных оснований	18, ΔG -0.96 ккал • моль-1 (2) — ΔG -8.19 ккал • моль-1 (4)	17, ΔG -2.24 ккал • моль-1 (2) — ΔG -8.45 ккал • моль-1 (4)
Количество гетеродимеров, значение ΔG (ккал • моль-1), в скобках указано количество спаренных оснований	17, ΔG -1.46 ккал • моль-1 (2) — ΔG -9.97 ккал • моль-1 (5)
Порядковый № нуклеотида от начала гена, соответствующего 5'-концу праймера согласно нумерации Ch. salexigens DSM 3043T (AJ011103), в скобках указано название гена	253 ( ect A)	895 ( ect B)

* Степень вырожденности праймера рассчитывали, перемножая количество вариантов нуклеотидов в каждой позиции.

Апробирование праймеров

С целью оптимизации условий полимеразной цепной реакции провели несколько реакций, отличающихся значениями температуры на этапе отжига. Установлено, что наибольшая концентрация продукта ПЦР была получена при температуре отжига праймеров 50 ° С (рис. 2). Далее провели тестирование праймеров на ДНК матрице типовых штаммов валидных видов рода Salinicola в реакционной смеси того же состава при температуре отжига 50 ° С. Для штаммов S. salarius DSM 1844^T, S. peritrichatus JCM 18795^T, S. acroporae JCM 30412^T получен один продукт длиной около 1200 п.н., соответствующий рассчитанной длине такового Ch. salexigens DSM 3043^T. В то время как на ДНК матрице штамма S. socius SMB35^T амплификация привела к синтезу одного неспецифического фрагмента длиной около 200 п.н., отличающегося от ожидаемой.

Для штамма S. halophilus CECT 5903^T ПЦР-продукт не был синтезирован (рис. 3а). Используемые праймеры являются вырожденными, т.е. представляют смесь комбинаций нуклеотидных последовательностей в неизвестном соотношении. Вероятно, концентрация варианта олигонуклеотида, комплементарного нуклеотидным последовательностям генов-мишеней штаммов S. halophilus CECT 5903^T и S. socius SMB35^T, меньше других. Поэтому была увеличена концентрация олигонуклеотидов в ПЦР смеси с 10 пкмоль до 50 пкмоль, что привело к синтезу искомого фрагмента на матрице ДНК штаммов S. socius SMB35^T и S. halophilus CECT 5903^T (рис. 3б). Но на матрице ДНК штамма S. socius SMB35^T были синтезированы неспецифические фрагменты размером около 800 п.н. и 200 п.н.

а

М 1 2 3 4 5 6 7 8 М

Рис. 2 . Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ect -оперона штамма S. pe-ritrichatus JCM 18795^T при разных температурах отжига праймеров (а) и концентрация ПЦР-продукта, оцененная по интенсивности свечения амлифицированного фрагмента ДНК (б):

1 — 38 ° С, 2 — 39 ° С, 3 — 42 ° С, 4 — 46 ° С, 5 — 50 ° С, 6 — 54 ° С, 7 — 57 ° С, 8 — 58 ° С; М — маркер молекулярных длин 100 bp Plus («Thermo Fisher Scientific, США»)

Для подтверждения амплификации фрагмента ect- оперона была определена нуклеотидная последовательность ПЦР-продуктов типовых штаммов S. salarius DSM 1844^T, S. peritrichatus JCM 18795^T,

S. acroporae JCM 30412T, S. halophilus CECT 5903T. Последующий сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с депонированными в публичных базах ect-генами с помощью программы Blastn выявил их гомологию с ect-генами бактерий рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

а

М 1 2 3 4 5 К М б

М 1 2 3 4 5 К

Рис. 3 . Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ect -оперона штаммов рода

Salinicola при концентрации праймеров 10 пкмоль (а) и 50 пкмоль (б):

• 1    — S. peritrichatus JCM 18795^T, 2 — S. acropo-rae JCM 30412^T, 3 — S. salarius DSM 1844^T, 4 — S. socius SMB35^T, 5 — S. halophilus CECT 5903^T,

M — маркер молекулярных длин 100 bp Plus («Thermo Fisher Scientific, США »), K — отрицательный контроль без ДНК

Заключение

Таким образом, предложенную систему праймеров можно использовать для амплификации фрагмента ect -оперона у бактерий рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Министерства образования и науки Пермского края в рамках проекта № 17-44590178.