Дополнительный лабораторный анализ ветеринарно-санитарного направления: выявление токсинов и микроорганизмов с применением цифровых технологий

В складывающихся условиях, на современном этапе, требования, предъявляемые в референтной лаборатории к проведению арбитражных лабораторных исследований в зависимости от аттестации доброкачественности продукции имеют несколько уровней сертификации [4,5,6] и зачастую являются очень высокими. Весьма часто возникает необходимость проведения комплексной ветеринарно-санитарной экспертизы (контрольно-надзорной функции), куда помимо традиционных микробиологических и паразитологических исследований также входят исследования на уровне остаточных количеств на наличие микотоксинов в органах и тканях [1,3].

Не лишним будет отметить, что при использовании оборудования, уменьшающего значение человеческого фактора, значительно возрастает эффективность используемого метода анализа. Классические методы микробиологических и токсикологических исследований, используемые в практике ветеринарных лабораторий, практически всегда довольно длительны по времени и нередко требуют больших затрат труда и времени [1,2]. Именно поэтому использованию аппаратных методов анализа в лабораторной практике во всё большем размере в последние годы уделяется внимание, и они получают всё большее признание.

Материал и методы исследований.

Научно обоснованными, перспективными технологиями и приборами, удовлетворяющими современным потребностям ветеринарных лабораторий является использование аппаратов серии Денситометр (Densitometer), в комплект поставки которых для информационной обработки анализируемых пластин входит программное обеспечение для цифровой обработки получаемых с помощью устройств видеозахвата изображений и приборы серии БакТрак (BacTrack), для получения быстрых и надёжных результатов одновременно исследуемых в микробиологическом отношении даже при большом числе образцов, предполагающих использование импедансных технологий.

Согласно современным представлениям, импеданс – это величина, характеризующая сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал; математически является функцией изменения ёмкостного сопротивления при определённой частоте и активной проводимости. Импедансная микробиология, являясь непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов с использованием определения электрического импеданса, представляет собой перспективное направление в исследованиях, поскольку химический состав в питательной среде изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов, и, соответственно, происходит его изменение, регистрируемое приборами.

В процессе жизнедеятельности, исследуемые микроорганизмы, выделяя ферменты, метаболизируют белки до аминокислот, углеводы и жиры – до органических кислот. Образующиеся метаболиты более подвижны, так как имеют меньший размер. Заряженные конечные продукты метаболизма выделяются в ростовую среду и эти электрохимические изменения в ростовой среде приводят к существенному изменению импеданса. При этом субстраты из незаряженных или слабо заряженных превращаются в сильно заряженные конечные продукты, что отражается в регистрируемых величинах.

Величина импеданса в течение времени образует графически кривую, ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе. Временем определения импеданса (IDT) принято считать переменную величину, необходимую для достижения значимого изменения импеданса. Экспоненциальные изменения импедансного сигнала могут наблюдаться уже в то время, когда количество микроорганизмов достигает порога 106 – 107 микробных клеток в 1 мл субстрата [1,5,6]. Это значение в исследуемой пробе обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов.

Хорошо зарекомендовавшим себя, доступным и дешёвым методом количественного и полуколичественного анализа всех классов низкомолекулярных органических соединений, неорганических веществ и высокополимеров является тонкослойная хроматография (ТСХ) – выполняемый с помощью специального оборудования на пластинах, покрытых слоем сорбента. Пластины как в России так и за рубежом выпускаются на полимерной или алюминиевой подложке с нанесённым рабочим слоем фракционированного сорбента толщиной 90-120 мкм, закреплённой специальным связующим компонентом.

На более ранних этапах, когда оценку анализа приходилось делать вручную, это отнимало много времени и часто давало ошибочные результаты. В настоящее время всё более широко распространяется аппаратный метод денситометрической оценки пластин с анализами.

Электронно-вычислительная машина, соединённая с Денситометром, используя математические алгоритмы, выводит относительную концентрацию и строит график зависимости концентрации как по площади пика, так и по его высоте (интенсивности пятна), с применением общепринятых в тонкослойной хроматографии показателей, таких, как Rf, Rh, S, H, причём показатели кривых могут несколько отличаться друг от друга в зависимости от того, какая аппроксимация была выбрана оператором - линейная или квадратичная, по площади или по высоте пика, что повышает точность исследования, и впоследствии, введя значения для стандарта (а в качестве стандарта может быть использовано вещество с различной заранее известной концентрацией), мы, в ряде случаев с лёгкостью получаем абсолютные значения присутствующих в исследуемой пробе веществ с использованием метода внешнего стандарта (методом абсолютной калибровки) [4,5]. В случае невозможности количественного анализа его проводят полуколичественно и продолжают исследования посредством газожидкостной хроматографии или на высокоэффективном жидкостном хроматографе.

Учитывая достоинства прибора БакТрак, следует пояснить, что он является автоматизированной экспресс - системой для ускоренной количественной и качественной оценки степени контаминации в микробном отношении продовольственного сырья, пищевых продуктов, косметической и фармацевтической продукции, питьевой воды и других объектов внешней среды.

Обобщённые результаты всех полученных исследований, в обоих случаях использования названных приборов, обрабатываясь математически, заносятся в таблицу и сводятся в подробный, с красивым интерфейсом протокол (отчёт), что, несомненно, повышает качество лабораторной работы и позволяя более качественно представлять полученные результаты исследований, поднимает авторитет лаборатории как среди клиентов, так и среди коллег (коллектива)       результат исследований показал, что в учреждения.                                 жевательных мышцах, взятых от туш

По результатам исследований в      говядины в одном из хозяйств, было представленной статье мы остановимся на      обнаружено более 3 цистицерков на одном описании работы приборов БакТрак марки      из разрезов, а также микрофлора,

SY – LAB instruments GMBH. Austria и      отнесённая       к       представителям

Денситометра марки Сорбфил, которые мы      грамположительных и грамотрицательных использовали в комплексной ветеринарно-      микроорганизмов, дающая реакцию на санитарной экспертизе сырья животного      цветном ряде сахаров.

происхождения, где микробиологически            В дальнейшем, исследуя в исследовалось количество мезофильной,      компрессориуме    препараты    ножек анаэробной, факультативной анаэробной      диафрагмы, в каждом срезе в поле зрения микрофлоры с последующим анализом      микроскопа при использовании объектива животного сырья на наличие остаточного      х8 было обнаружено до 5 личинок количества микотоксинов и количественной      трихинелл, а при микробиологическом оценки кривой импедансного сигнала и      исследовании выделена грамположительная калибровочных     кривых     анализа      микрофлора, ферментирующая сахара, видеоизображения    хроматограмм    с      позволяющая по этому признаку помощью ЭВМ. Следует отметить, что      типизировать её.

БакТрак и Денситометр обозначенных           При           микробиологических марок      оснащены      программным      исследованиях печени,    поражённой обеспечением с удобным интерфейсом,      дикроцелиями, была  выявлена помимо которое позволяет как дробно, так и      грамположительной и грамотрицательной комплексно очень быстро проводить      микрофлоры  также денситометрическая расчёты      основных      показателей,      картина      остаточных      количеств характеризующих        математическое      микотоксинов (афлатоксин В1,   М1, выражение функции проводимого анализа.        охратоксин,  Т-2 токсин, зеараленон),

При некоторых анализах нами была      которые в ряде случаев имели использована     щелочная     фракция      концентрацию, превышающую предельно электрохимически активированной воды с      допустимую (ПДК) в десятки раз. Это рН 11,0 (для усиления роста культур      служит признаком того, что личиночные сальмонелл) [1,2,6]. Следует указать, что       формы гельминтов могут активно нами использовались, преимущественно      накапливать в себе токсичные метаболиты ростовые среды серии BiMedia, но мы в      плесеней и продукты их переработки в последующем верифицировали опыт в      животном организме. Последствиями этого трёхкратной повторности с использованием      (например, при дегельминтизации) может классической триады Генле-Коха в      быть их резкое высвобождение.

обычных лабораторных условиях на мясо-           Выводы. В случаях, когда срочно пептонном агаре, мясо-пептонном бульоне      требуется провести микробиологический и последующей биохимической типизацией      анализ, прибор БакТрак может являться в полученных колоний микроорганизмов с      ветеринарно-санитарном обслуживании помощью пластин биохимических фирмы      важным моментом в повышении качества,

НПО «Диагностические системы».              поскольку использует импедансные

Результаты исследований и их      технологии. На основании вышесказанного обсуждение. Основанием для описания      мы считаем целесообразным использовать результатов исследований, приведённых в      ТСХ и Денситометр, поскольку они данной статье мы считали результаты      позволяют выявить даже незначительные, анализа внутренних органов 14 животных, у      остаточные количества микотоксина в которых        ветеринарно-санитарными      исследуемом материале. В анализах, экспертами было выявлено наличие      использующих комплексный алгоритм в различных видов паразитов гельминтного      ветеринарно-санитарной экспертизе, этот происхождения, при этом первичный      момент весьма важен.

ЛИТЕРАТУРА:  1. Поветкин, С.Н. Сравнительная эффективность бактерицидного действия электрохимически активированных растворов гипохлорита и хлорида натрия и питьевой воды на возбудителей колибактериоза и сальмонеллеза / С.Н. Поветкин., В.И.

Дорофеев // Труды Кубанского государственного аграрного университета.- 2008.- №4 (13).-с.187 – 189. 2. Получение, фармакологические свойства и применение электрохимически активированной воды при эшерихиозах и сальмонеллезе поросят. Поветкин С.Н. диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Кубанский государственный аграрный университет. Краснодар, 2009. 3. Зирук, И.В. Морфология печени подсвинков при добавлении в рацион нового минерального комплекса / И.В. Зирук // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 4. С. 18-19. 4. Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-бактериологического исследования объектов окружающей среды: Методические рекомендации.- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005.- 59 с. 5. Морфология и микрофлора толстого отдела кишечника при добавлении в корма подсвинков хелатов / Зирук И.В. // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014. № 2 (112). С. 103-106. 6.

Антитоксическое действие биомассы дрожжевой культуры, обработанной электрохимически активированной водой против афлатоксинов B1 и M1 в кормах для животных Поветкин С.Н., Мирошниченко П.В., Якимов Г.В., Якимов Ю.В., Ольховик Ж.П. Вопросы нормативно правового регулирования в ветеринарии. 2010. № 4. С. 103-104.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ЛАБОРАТОРНЫЙ АНАЛИЗ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАПРАВЛЕНИЯ: ВЫЯВЛЕНИЕ ТОКСИНОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЦИФРОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Поветкин С.Н., Шантыз А.Х., Якимов Ю.В., Родин И.А., Зирук И.В., Осипчук Г.В., Вачевский С.С.

Резюме

Представлен обзор возможности применения приборов, подразумевающих применение современных технологий (импедансных, цифровой обработки хроматограмм), а также денситометрии применительно к ветеринарно-санитарной экспертизе. Подход важен как пример комплексного использования методик по освещаемому вопросу.

ADDITIONAL LABORATORY ANALYSIS OF THE VETERINARY SANITARY DIRECTION: IDENTIFICATION OF TOXINS AND MICROORGANISMS WITH APPLICATION OF DIGITAL TECHNOLOGIES

Povetkin , S.N.,. Shantyz A.Ch, Yakimov Y.V., Rodin I.A., Ziruk I.V., Osipchuk G.V., Vachevskiy S.S.