EPCAM+CD45+ клетки в асцитической жидкости больных новообразованиями яичников: связь с уровнями онкомаркеров и степенью злокачественности

В терминальных стадиях рак яичников приводит к асциту [1, 2]. Значительный интерес среди злокачественных клеток, определяемых в асцитической жидкости, вызывает недавно открытая группа атипичных/гибридных клеток, образующихся в результате слияния раковой клетки и лейкоцитов. Такие клетки экспрессируют маркер CD45, характерный для всех видов лейкоцитов человека [3] и EpCAM – молекулу клеточной адгезии эпителия, обнаруживающуюся у большинства раковых эпителиальных клеток [4, 5] и в 70 % случаев рака яичников [6, 7].

Группа EpCAM+CD45+ клеток неоднородна, и на данный момент представлена, как минимум, двумя популяциями – Cancer-Associated Macrophage-Like cell (CAML) и Circulating Hybrid Cells (CHC) [8]. Морфологически первая популяция отличается

увеличенными размерами, неправильной формой и многоядерностью [9], тогда как вторая сохраняет относительное сходство с родительским лейкоцитом [10]. Функционально же, судя по имеющимся данным, все популяции гибридов схожи – комбинация из способностей к активному движению и к бесконтрольному росту и размножению делает гибридные клетки потенциальной причиной метастазирования опухоли [11]. При этом их значительные концентрации в большинстве биологических жидкостей, включая асцитическую [7, 12], даже на самых ранних этапах заболевания [13] открывают возможности для подсчета EpCAM+CD45+клеток в качестве предиктивных маркеров онкологических заболеваний [14].

Цель исследования – оценить особенности взаимосвязи атипичных/гибридных форм EpCAM+CD45+ клеток в асцитической жидкости

Таблица /table

Уровень атипичных/гибридных форм epcaM+cd45+ клеток и онкомаркеров ca125, He4 у больных с новообразованиями яичников atypical/hybrid forms of epcaM+cd45+ cell and the levels of СА125 and He4 markers in patients with ovarian neoplasms

Показатель/Parameter	LGSC	Группа исследования/Study group HGSC	ПОЯ/BOT
CD45+EpCAM+, кл/мкл/ D45+EpCAM+, cells/ µl	0,55 (0,03; 4,51)	1,36 (0,41; 2,68) p1=0,29	0,04 (0; 0,66) p2=0,17; p3=0,01
CA125, ед/мл/ CA125, U/ml	170 (42,06; 489,05)	71,3 (51; 544) p1=0,63	6,39 (4,75; 9,5) p2=0,02; p3<0,01
HE4, пМ/л/ HE4, pmol/l	239,5 (181,55; 501,7)	130 (82; 335) p1=0,30	26,25 (0; 44,3) p2<0,01; p3<0,01

Примечание: p1 – значение p, полученное в результате применения критерия Манна–Уитни для сравнения двух независимых выборок групп HGSC и LGSC; p2– для LGSC и ПОЯ; p3 – для HGSC и ПОЯ.

у больных новообразованиями яичников с уровнем онкомаркеров СА125, HE4 и степенью злокачественности опухоли.

Материал и методы

В клиническое исследование NCT04817501 были включены 42 пациентки с впервые диагностированным раком яичников Ic CA–IV стадии по FIGO, из которых 13 человек – с Low-grade серозной карциномой яичников (LGSC), 29 – с High-grade серозной карциномой яичников (HGSC). Группу сравнения составили 6 женщин с пограничными новообразованиями яичников (ПОЯ). Все пациентки получали лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ и/или Томском областном онкологическом диспансере. Возраст больных ‒ от 36 до 76 лет.

Материалом для исследования служили 5 мл стабилизированной ЭДТА асцитической жидкости, взятой во время лапароскопии, а также 5 мл крови. Наличие атипичных/гибридных форм EpCAM+CD45+ клеток в асцитической жидкости определяли методом многоцветной проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре No-voCyte (Agilent Technologies, США) с помощью меченных различными флюорохромами моноклональных антител к CD45 (CD45-APC-Cy7, Biolegend, США) и EpCAM (EpCAM-BV605, Biolegend, США), а также витального красителя NucBlue Live Cell Stain Ready Probes reagent (Invitrogen, США). Методом ИФА определялся уровень онкомаркеров СА125 и HE4 в сыворотке крови с помощью наборов фирмы «Вектор Бест» (Россия).

Результаты исследования обрабатывали с использованием программ Microsoft Excel 2019 (Microsoft, США) и STATISTICA 13.5 (TIBCO Software Inc., США). Проверка на соответствие выборок нормальному закону распределения проводилась критерием Шапиро–Вилка. Связь между двумя выборками, не подчиняющимися

нормальному закону распределения, оценивали с помощью корреляции Спирмена. Статистическую значимость различий независимых выборок оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости p<0,05. Результаты представлены в виде медианы и межквартильного размаха Ме (Q1; Q3).

Результаты

В результате проведенного исследования в асцитической жидкости больных раком яичников были выявлены атипичные/гибридные формы EpCAM+CD45+ в концентрации 1,02 (0,3–2,68) клеток/мкл. Средние уровни онкомаркеров СА125 и HE4 составили 129 (51; 544) ед/мл и 209 (82; 472) пМ/л соответственно (таблица). В подавляющем большинстве случаев по результатам проточной цитометрии асцитической жидкости больных раком яичников мы наблюдали не одно, а два облака EpCAM+CD45+ клеток (рис. 1).

При статистической обработке данных установлены прямые корреляции между уровнями СА125 и HE4 в крови среди всех пациенток (R=0,60; p<0,01), больных LGSC (R=0,79; p<0,01) и HGSC (R=0,52; p<0,01). Обнаружены достаточно сильные корреляции между концентрациями EpCAM+CD45+ клеток в образцах асцитической жидкости больных LGSC и уровнями СА125 (R=0,93; p<0,01) и HE4 (R=0,68; p=0,03) крови. У пациенток с HGSC зависимости между концентрацией гибридных клеток и HE4 не обнаружено (R=-0,16; p=0,51), а в случае СА125 – только на уровне статистической тенденции (R=0,38; p=0,08) Корреляция между этими параметрами в общей группе исследования обнаружена с уровнем СА125 (R=0,51; p<0,01), но не в случае HE4 (R=0,08; p=0,69) (рис. 2).

Проведенное исследование показало, что значимых различий между количеством EpCAM+CD45+ клеток у пациенток с LGSC и HGSC обнаружено

Note: p1 – p value obtained after Mann–Whitney U test to compare two independent distributions of HGSC and LGSC groups; p2 – for LGSC and BOT groups; p3– for HGSC and BOT groups.

Рис. 1. Типичная скаттерограмма, полученная в ходе цитоф-луориметрического исследования асцитической жидкости Fig. 1. Typical scatterplot acquired after flow cytometry of an ascitic fluid sample

Рис. 2. А–В) ‒ cкаттерограммы значений EpCAM+CD45+ клеток асцитической жидкости, CA-125 и HE4 крови в общей группе пациенток;

Г–Е) – для группы LGSC; Ж–И) – для группы HGSC

Fig. 2. A–C) Scatterplots of EpCAM+CD45+ cells in ascitic fluid, blood CA-125 and HE4 values of all patients; D–F) – of LGSC patients; G–I) – of HGSC patients

Рис. 3. А–В) ‒ диаграммы размаха значений EpCAM+CD45+ клеток асцитической жидкости, CA-125 и HE4 крови между пациентками с LGSC и HGSC; Г–Е) – между пациентками с серозными карциномами яичников (РЯ) и пограничными новообразованиями (ПОЯ)

Fig. 3. A–C) Boxplot of EpCAM+CD45+ cells in ascitic fluid, blood CA-125 and HE4 values between the LGSC and HGSC patients; D–F) Boxplot of EpCAM+CD45+ cells in ascitic fluid, blood CA-125 and HE4 values between the ovarian cancer patients and borderline ovarian tumors

не было (p=0,29), как и для концентрации СА125 (p=0,63) и HE4 (p=0,30) (рис. 3 А–В). По сравнению с пациентками, у которых выявлена серозная карцинома яичников, концентрации гибридных клеток, СА125 и HE4 у больных ПОЯ снижены в разы (p=0,02; p<0,01 и p<0,01 соответственно) (рис. 3 Г–Е).

Обсуждение

Основным достижением представленного исследования стало обнаружение сильной связи между количеством EpCAM+CD45+ клеток и концентрацией онкомаркеров в группе больных LGSC. Роль гибридных клеток в патогенезе рака до конца не изучена. Большинство авторов склоняются к мнению, что появление EpCAM+CD45+ клеток в больших количествах является плохим прогностическим фактором, прямо связанным со стадией заболевания и выживаемостью. Ряд работ показывает их способность к быстрому делению, активной инфильтрации тканей и к образованию метастазов [11, 13, 15, 16]. Однако описание различных популяций гибридных клеток наводит на мысль, что не все гибриды могут участвовать в метастазировании. Более того, в настоящем исследовании вполне могли быть обнаружены здоровые макрофаги с поглощенным содержимым раковых клеток вместе с их маркерами. В пользу этого свидетельствует отсутствие корреляции между концентрациями гибридов и онкомаркеров в случаях HGSC. Активный рост опухоли вызван быстрым делением раковых клеток. В условиях ограниченного объема среди них неизбежно начинается «естественный отбор», приводящий к гибели множества наименее приспособленных клеток [17]. Их компоненты выходят в кровь и асцитическую жидкость, где и поглощаются макрофагами. Однако процесс отбора наиболее жизнеспособного клона случаен. В одном случае может происходить активная наработка клонов, когда в другом первоначальный клон уже максимально приспособлен к существованию, и отбор нового не происходит. Поэтому концентрация EpCAM+CD45+ клеток в случае HGSC подвержена сильным флуктуациям. На данный процесс также влияют и внешние факторы в виде недостатка питательных веществ, гипоксии и активности противоопухолевого иммунитета [17], которые также подвержены частым, случайным изменениям в условиях активно растущей опухолевой массы. В случае же LGSC опухоль растет медленнее, активность деления клеток ниже, а случаи клеточной гибели – реже. Поэтому здесь гибридные клетки в большей степени представлены структурами, образованными в результате непосредственного клеточного слияния, количество которых прямо зависит от размера опухолевой массы, как и уровни онкомаркеров. Теорию присутствия нескольких популяций атипичных/гибридных клеток также подкрепляет факт наличия нескольких облаков сигналов EpCAM+CD45+ клеток на скаттерограм-мах проточного цитофлуориметра (рис. 1). Из этого также можно сделать вывод, что популяции гибридов отличаются по степени экспрессии Ep-CAM и CD45.

Рис. 4. Схематическое представление теории образования гибридных клеток, предложенных в данной работе Fig. 4. Schematic representation of hybrid formation theories proposed in this work

В настоящем исследовании корреляция между количеством EpCAM+CD45+ клеток в асцитической жидкости и уровнем HE4 в крови больных HGSC не найдена. Однако обнаружена корреляция между гибридами и СА125 в общей группе больных и в группе HGSC на уровне тенденции. Структура MUC16 включает в себя домены SEA, способные разрушаться в кислой среде. При этом муцин отсоединяется от поверхности клетки, после чего способен попасть в кровоток [18]. Поскольку концентрация СА125 линейно зависит от количества EpCAM+CD45+ клеток, можно предположить, что кислая среда, создаваемая опухолевой массой, является фактором, стимулирующим процесс клеточного слияния [19]. Прямое повреждение элементов гликокаликса (такого как MUC16) при низком pH открывает билипидный слой мембраны раковой клетки для прямого контакта с макрофагом [19]. Кроме того, отсутствие MUC16 на поверхности клетки стимулирует EMT, что повышает доступность раковых клеток для лейкоцитов [20]. Кислая среда активирует MMP9, положительное влияние которой на процесс гибридизации доказано на клетках рака молочной железы [21]. Другим доказанным фактором клеточного слияния является гипоксия [22], неразрывно связанная со снижением pH внеклеточной среды. Для точного установления роли кислой среды опухоли в механизме клеточного слияния требуется провести дополнительные исследования. Схемы обеих теорий представлены на рис. 4.

Обнаруженные нами корреляции между количеством EpCAM+CD45+ клеток асцитической