Фенольные соединения листьев Tanacetum balsamita L

Оригинальная статья / Original article

Forcitation: Krol T.A., Ossipov V.I., Baleev D.N. Phenolic compounds in leaves of Tanacetum bal-samita L. Vegetable crops of Russia. 2023;(6):66-70. (In Russ.)

Р од Tanacetum (Asteraceae), включающий порядка 160 видов, широко распространён в странах с умеренным климатом северного полушария [1, 2]. Многие виды данного рода содержат биологически активные вещества, обладающие антикоагулянтной, противомик-робной и цитотоксической активностью [3, 4, 5]. Некоторые виды обладают антигельминтным, гепатопро-текторным, спазмолитическим и вяжущим действием [6, 7]. Один из представителей данного рода, пижма обыкновенная (Tanаcetum vulgare L.), включен в государственную фармакопею РФ (ФС.2.5.0031.15) [8]. На основе экстракта ее цветков разработан и выпускается препарат Танацехол [9]. Другой вид, пижма бальзамическая (Tanacetum balsamita L.), используется с древних времен в народной медицине многих стран [2, 10]. Ее культиви- руют в качестве пищевого, лекарственного и пряно-ароматического растения [11]. Свежие и сушеные листья используются при приготовлении салатов и в качестве приправы благодаря лимонно-мятному аромату и сладковато-вяжущему вкусу [10].

Tanacetum balsamita L. (syn. Chrysanthemum balsamita (L.) Baill, Balsamita major (L.) Desf) - многолетнее корневищное растение высотой 30-120 см [12, 13]. Листья серовато-зелёного цвета, цельные, овальные или эллиптические, по краю зубчатые. Молодые листья покрыты серебристыми волосками. Нижние листья черешковые, верхние – сидячие. Полушаровидные мелкие корзинки собраны в рыхлое щитковидное соцветие. Плод – семянка [12, 13]. Родина этого растения – Малая Азия. В природе произрастает в Западном и Южном Закавказье, в Армении, на севере Ирана [10].

Надземные части T. balsamita содержат до 1,2% эфирного масла [14]. Эфирное масло включает α-туйон, β -туйон, камфору, транс-хризантенилацетат, 1,8-цинеол и карвон [2, 15]. В настоящее время у T. balsamita выделяют четыре хемотипа: карвоновый, камфорный, камфорно-туйоновый и карвон– α -туйоновый [13]. В листьях присутствуют полифенольные соединения, содержание которых составляет порядка 64,50 мг/100 г [16]. В T. balsamita идентифицировано более 100 вторичных метаболитов [10]. Фенольные соединения представлены гидроксико-ричными кислотами (производные кофеоилхинной кислоты) и флавоноидами (гликозиды апигенина, лютеоли-на, диосметина, акацетина и кверцетина) [2, 16].

На базе Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений имеются коллекции лекарственных и эфирномасличных растений, обладающие уникальным генетический потенциалом, на основе которых создаются новые адаптированные сорта с высоким содержанием биологически активных соединений [17]. Семейство Asteraceae широко представлено в «Биоколлекции видов лекарственных и ароматических растений открытого и защищенного грунта». Изучение химического состава растений, представленных в биоколлекции, является важной и актуальной задачей. Целью нашего исследования было изучение качественного состава листьев T. balsamita , произрастающей в Ботаническом саду лекарственных растений ФГБНУ ВИЛАР, методом ультра-эффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием в сочетании с масс-спектрометрией (УЭЖХ-ДД-МС).

Материалы и методы

Объект исследований. Объектом исследования были листья T. balsamita , собранные в период цветения в 2019 году. Растения произрастали на территории Ботанического сада лекарственных растений ФГБНУ ВИЛАР. Исследования проводились с использованием биообъектов Уникальной научной установки «Биоколлекции ФГБНУ ВИЛАР».

Подготовка образцов. Охлажденные листья замораживали, лиофильно высушивали (Labconco FreeZone 2.5 L, США) и измельчали (MM 400, Retsch, Германия). Образец сухих листьев массой 15 мг (CPA 225D, Sartorius, Германия) экстрагировали 1 мл 80% ацетона (для хроматографии, Компонент-Реактив, Россия) в течение 60 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании (VORTEX Genie 2, Scientific Industries, США). Экстракт центрифугировали в течение 20 минут при 14000 об/мин (Eppendorf 5430R, Германия) и упаривали досуха при 45°С (концентратор CentriVap, Labconco, США). Экстракция образца трехкратная. Полученный сухой экстракт растворяли в 1 мл деионизованной воды в течение 60 минут, центрифугировали в течение 20 минут при 14000 об/мин, разбавляли в 5 раз деионизованной водой (Direct-Q3, Merck, Германия) и фильтровали (PTFE filter Clean 2, 0,45 µм, Thermo Fisher Scientific, США).

УЭЖХ анализ. Для УЭЖХ-ДД-МС анализа использовали ультра-эффективную жидкостную хроматографическую систему (УЭЖХ, Acquity UPLC^® 2.9.0, Waters Corporation, Милфорд, США), которая включала фотодиодный детектор (190-500 нм) и тройной квадрупольный масс-спектрометр Xevo TQ (Waters Corporation, Милфорд, США). В градиентной программе использовали 0,1% муравьиную кислоту (А) и ацетонитрил (Б): 0-0,5 мин, 0,1% Б в А; 0,5-5,0 мин, 0,1-30,0% Б в А (линейный градиент); 5,0-6,0 мин, 30-35% Б в А (линейный градиент). Скорость потока элюента составляла 0,5 мл/мин, объем введённого образца – 5 мкл [18]. Использовали регистрацию отрицательных ионов. Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием программы DataAnalysis 4.0.

Идентификация фенольных соединений. Идентификация соединений была основана на интерпретации спектральных данных УФ- и МС-спектров, поиске в доступных базах масс-спектрометрических данных химических соединений (HMDB) [19] и сравнении с литературными данными [10].

Результаты и их обсуждение

В результате проведенного анализа фенольный профиль экстракта из листьев T. balsamita (рис. 1) был представлен 17 соединениями (фенольные кислоты и флавоноиды). Четыре соединения не были идентифицированы (табл.).

Соединения 1, 3, 8, 9 и 11 имели УФ-спектр, характерный для кофейной кислоты с максимумами поглощения в области 244, 297 пл, 325 нм (рис. 2). В масс-спектре соединения 1 присутствовали депротонированный ион [М-Н]^- m/z 353 и его димер m/z 707 [2М-Н]^-, а также характерный фрагмент с m/z 191, соответствующий иону [Хинная кислота-H]^-. Это позволило идентифицировать данное соединение как кофеоилхинную кислоту. Соединение 3 имело ион [M-H]^- с m/z 367 и [2M-H]^- с m/z 734, что соответствует ферулоилхинной кислоте.

Рис. 1. УЭЖХ-УФ (280 нм) профиль фенольных соединений листьев T.balsamita. Обозначения: 1 – кофеоилхинная кислота; 2 – гексозид феруловой кислоты,изомер 1; 3 – ферулоилхинная кислота; 4 – гексозид феруловой кислоты,изо-мер 2;5 – лютеолин-7-глюкозид;6 – лютеолин-гексуронид;7 – лютеолин-O-гексозид-O-ацетилгексозид;8 – дикофе-оилхинная кислота,изомер 1; 9 – дикофеоилхинная кислота,изомер 2; 10 – лютеолин-7-O-(6 ″ -ацетилглюкозид); 11 – дикофеоилхинная кислота,изомер 3;12 – хризоэриол-гексуронид; 13 – неизвестное соединение; 14 – производное хризоэриола; 15 – неизвестное соединение; 16 – производное лютеолина,17 – спинацетин/аксилларин

Fig. 1. UPLC-UV (280 nm) profile of phenolic compounds ofleaves T.balsamita. Number compounds from Table 1: 1 – caf-feoylquinic acid;2 – ferulic acid hexoside,isomer 1; 3 - feruloylquinic acid; 4 – ferulic acid hexoside,isomer 2;5 - luteolin-7-gluco-side;6 - luteolin-hexuronide;7 – luteolin-O-hexoside-O-acetylhexoside;8 – dicaffeoylquinic acid,isomer 1;9 – dicaffeoylquinic acid, isomer 2; 10 – luteolin-7-O-(6 ″ -acetylglucoside); 11 – dicaffeoylquinic acid,isomer 3; 12 - chrysoeriol-hexuronide; 13 -unknown compound; 14 - chrysoeriol derivative; 15 - unknown compound; 16 - luteolin derivative,17 - spinacetin/axillarin

Рис. 2. Примеры МС- и УФ-спектров соединений листьев T. balsamita:

А – кофеоилхинная кислота;В – лютеолин-гексуронид; С – хризоэриол-гексуронид

Fig.2. Examples of MS spectra and UV spectra compounds ofleaves T.balsamita:

A – caffeoylquinic acid; B - luteolin-hexuronide; C - chrysoeriol-hexuronide

Идентификация подтверждается наличием m/z фрагментов 191 и 193, соответствующих хинной и феруловой кислотам.

Анализ масс-спектров соединений 8, 9 и 11 показал наличие основного депротонированного иона [M-H]-сm/z 515, иона [2М-Н]-с m/z 1031 и фрагментов исходного иона с m/z 353 и 191, соответствующих кофеоилхинной и хинной кислотам. Данные соединения были идентифицированы как изомеры дикофеоилхинной кислоты. Для установления их точной структуры необходимы дополнительные исследования. Кофеоилхинные и дикофеоилхинные кислоты обладают широким спектром фармакологиче- ских свойств. Они проявляют противовоспалительную, противоопухолевую, гепатопротекторную, антимикробную и антиоксидантную активность, оказывают нейро-протекторное действие [20].

УФ-спектр соединений 2 и 4 имел максимумы поглощения при 243, 301 и 325 нм. Основными ионами в масс-спектре этих соединений были ионы с m/z 355 и 711, соответствующие [M-H]^- и [2M-H]^-. Соединения 2 и 4 были идентифицированы как изомеры гексозида феруловой кислоты, что подтверждается присутствием в масс-спектрах m/z фрагмента 193, который соответствует иону [Феруловая кислота-H]^-.

Таблица. Результаты УЭЖХ-УФ-МС идентификации фенольных соединений листьев T. balsamita Table. Results of UPLC-UV-MS identification of phenolic compounds in leaves of T. balsamita

№	Соединение (молекулярная формула)	Rt, мин.	УФ макс., нм	Значение m/z аддукта или фрагмента
				[M-H]-	[2M-H]-	фрагменты
1	Кофеоилхинная кислота (С 16 Н 18 О 9 )	2.93	244; 297пл; 325	353	707	191
2	Гексозид феруловой кислоты (изомер 1) (C 16 H 20 O 9 )	3.32	229; 302	355	711	193
3	Ферулоилхинная кислота (С 17 Н 20 О 9 )	3.77	243; 301; 325	367	734	173; 191; 193; 297
4	Гексозид феруловой кислоты (изомер 2) (C 16 H 20 O 9 )	3.95	237; 294; 319	355	711	193
5	Лютеолин-7-глюкозид (C 21 H 20 O 11 )	4.25	253; 348	447	895	283; 285
6	Лютеолин-гексуронид (C 21 H 18 O 12 )	4.28	253; 348	461	923	283; 285
7	Лютеолин-O-гексозид-O-ацетилгексозид (C 29 H 32 O 17 )	4.41	254; 264; 348	651	-	173; 191; 263; 285
8	Дикофеоилхинная кислота (изомер 1) (С 25 Н 24 О 12 )	4.52	244; 304; 325	515	1031	177; 191; 353
9	Дикофеоилхинная кислота (изомер 2) (С 25 Н 24 О 12 )	4,65	243; 324	515	1032	191; 353
10	Лютеолин-7-O-(6″-ацетилглюкозид) (C 23 H 22 O 12 )	4.71	254; 344	489	-	175; 246; 283; 285; 325
11	Дикофеоилхинная кислота (изомер 3) (С 25 Н 24 О 12 )	4.75	251; 329	515	1031	191; 353
12	Хризоэриол-гексуронид (C 22 H 20 O 12 )	4.89	252; 266; 345	475	951	161; 299
13	Неизвестное соединение	5.19	266; 336	487	975	269; 283; 299;
14	Производное хризоэриола	5.33	252; 266; 345	517	-	161; 199; 299
15	Неизвестное соединение	5.51	229; 283; 326	519	-	301
16	Производное лютеолина	5.63	253; 348	531	-	193; 283
17	Спинацетин/аксилларин (C 17 H 14 O 8 )	5.70	257; 293; 351	345	-	300; 315; 330

Соединения 5, 6, 7 и 10 имели характерный для лютео-лина УФ-спектр с максимумами поглощения в области 253-254 и 344-348 нм (рис. 2). При изучении масс-спектров данных соединений было установлено присутствие одинакового m/z фрагмента 285, который соответствует m/z агликона лютеолина. В масс-спектре соединения 5 обнаружен ион [M-H]^- с m/z значением 447 и его димер с m/z значением 895 [2M-H]^-. Данный флавоноид идентифицирован как лютеолин-7-глюкозид, что подтверждается также анализом литературных данных [10]. Соединение 6 идентифицировано как лютеолин-гексуро-нид по наличию в масс-спектре ионов 461 [M-H]^- и 923 [2M-H]^-. Соединения 7 и 10 идентифицированы как лютео-лин-O-гексозид-O-ацетилгексозид ( m/z 651) и лютеолин-7-O-(6″-ацетилглюкозид) ( m/z 489) соответственно. Соединение 16 дало основной ион с m/z 531. УФ-спектр данного соединения соответствует лютеолину. Точно идентифицировать данное соединение не удалось, возможно это может быть лютеолин-7-[6-O-(2-метилбути-рил)-глюкозид]. Однако для более точной идентификации необходимо проведение дальнейших исследований.

Лютеолин является природным флавоном растений, который чаще всего присутствует в гликозилированной форме. Он обладает антиоксидантными, противоопухолевыми, противовоспалительными, противомикробны-ми, кардиопротекторными, антидиабетическими, нейро-протекторными и противоаллергическими свойствами [21; 22]. Лютеолин-7-О-глюкозид проявляет противовоспалительную активность и противоопухолевую активность (в отношении клеточной линии MCF-7). Он может служить для разработки препаратов при лечении воспалительных заболеваний кожи, а также сердечно-сосудистых заболеваний [22].

УФ-спектр соединений 12 и 14 имел максимумы поглощений в области 252, 266 и 345 нм, что характерно для хризоэриола (рис. 2). Анализ масс-спектра показал присутствие одинакового фрагмента с m/z 299, что соответствует хризоэриолу. Соединение 12 идентифицировано как хризоэриол-гексуронид (m/z 475). Соединение 14 (m/z 517) не удалось идентифицировать, однако, на основании полученных данных, можно предположить, что это производное хризоэриола. Хризоэриол представляет собой флавон, являющийся 3'-метоксипроизводным лютеолина. Обладает широким спектром фармакологической активности: противоопухолевой, противовоспалительной, антибактериальной, противогрибковой и анти-остеопорозной [23].

Соединение 17 имело характерный для флавоноидов УФ-спектр с максимумами поглощения в области 257, 293 и 351 нм. Анализ масс-спектра соединения 17 показал наличие основного депротонированного иона с m/z 345. Данное соединение можно идентифицировать как спинацетин или аксилларин, которые ранее были обнаружены в T. balsamita [10]. Спинацетин представляет собой O-метилированный флавонол.

Заключение

В результате проведенного УЭЖХ-ДД-МС анализа в листьях T. balsamita было обнаружено 17 фенольных соединений, 13 из которых были идентифицированы. Флавоноиды были представлены пятью производными лютеолина, двумя производными хризоэриола и спина-цетином/аксилларином. Фенольные кислоты – кофеоил-хинной, ферулоилхинной и тремя изомерами дикофео-лилхинной кислоты. Были идентифицированы два изомера гексозида феруловой кислоты. В листьях T. balsamita основными соединениями были кофеоилхинная и дико-феоилхинная кислоты. Исходя из полученных результатов в дальнейших исследованиях можно продолжить изучение противовоспалительной активности.

Aboutthe Authors:

Tatiana A.Krol – Cand. Sci. (Agriculture),

, Correspondence Author,

Vladimir I.Ossipov – Dr. Sc. (Biology),

,

Dmitriy N.Baleev – Cand. Sci. (Agriculture),

,