Фенотипические особенности клеток осадка мочи больных неинвазивным раком мочевого пузыря

В мире ежегодно диагностируется более 430 тыс. новых случаев рака мочевого пузыря (РМП). В структуре общей онкологической заболеваемости РМП составляет 3,1 % всех неоплазий и занимает 9-е ранговое место. Мужчины более чем в 4 раза чаще страдают данным заболеванием, 59 % случаев РМП регистрируется в экономически развитых странах [3]. В России ежегодно регистрируется более 16 тыс. новых случаев, что составляет 2,7 % всех злокачественных опухолей [1]. На момент первичного обращения у 70–80 % больных опухоль локализована в пределах слизистого (Та, Tis) или подслизистого слоя (стадия Т1) [4].

Неинвазивный характер исследования клеток осадка мочи, непосредственный контакт данной биологической среды с пораженным уротелием делают этот тест весьма перспективным индикатором возникновения РМП. Считается, что цитологическое исследование мочи имеет высокую чувствительность при низкодифференцированных опухолях мочевого пузыря и низкую – при высокодифференцированных. Опубликовано большое

количество обзоров по изучению диагностической значимости молекулярных маркеров мочи. Некоторые тестовые системы – UroVysion, ImmunoCyt и др. – применяются в клинической практике, однако ни одна из них не признана стандартным диагностическим методом [3]. Учитывая приведенные данные, представляет интерес исследование клеток осадка мочи, экспрессирующих различные поверхностные антигены у больных неинвазивным РМП. Полученные данные могут представлять интерес в оценке особенностей биологического течения и диагностике заболевания.

Целью исследования явилось определение экспрессии поверхностных маркеров на клетках осадка мочи у больных неинвазивным РМП.

Материал и методы

В исследование было включено 85 пациентов с неинвазивным РМП (TаN0M0, TisN0M0 или T1N0M0), получавших лечение на базе КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» (КККОД). Порцию мочи пациентов забирали до проведения им трансуретральной резекции (ТУР). Полученные образцы мочи центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл забуференного физиологического раствора (PBS), проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1–2 мин и центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования в течение 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD13, меченные фикоэритрином (РЕ – максимум флуоресценции на 578 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD15, меченные аллофикоцианином (АРС – максимум флуоресценции на 657,5 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Далее добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотио-ционатом (ФИТЦ – максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 мин. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACS Canto II (BectonDickinson, США).

Для формирования группы контроля аналогичным способом были исследованы клетки осадка мочи группы здоровых доноров (n=47).

После проведения ТУР всем пациентам проводилась внутрипузырная химиотерапия митомицином 40 мг внутрипузырно, 1 раз в нед, в течение 6–8 нед. Наблюдение за пациентами после окончания комбинированного лечения осуществлялось в течение 3 лет. На основании динамического наблюдения больные РМП были разделены на 2 группы: 1-я группа – с рецидивом заболевания (n=46); 2-я группа – без рецидива (n=35).

Клинико-морфологическая характеристика изучаемых групп

Таблица 1

Показатель		1-я группа (n=46)	2-я группа (n=39)
Степень дифференцировки	G1	34,9 %	250 %
опухоли	G2	53,5 %	58,7 %
	G3	11,6 %	16,3 %
	1	61,7 %	67,5 %
Количество выявленных	2	10,6 %	4,4 % %
очагов опухоли	3	4,3 %	4,4 % %
	>3	23,4 % %	23,7 %
	Задняя стенка	23,9 %	29,8 %
	Передняя стенка	–	1,8 %
	Боковая стенка	41,3 %	35,1 %
Локализация опухоли	Верхушка	–	0,9 %
	Шейка	4,3 %	2,6 %
	Дно	26,1 %	26,3 %
	Множественная	4,3 %	3,5 %
	<1 см	19,1 %	16,7 %
	1,0–1,9 см	21,3 %	23,7 %
Размер опухоли	2,0–2,9 см	21,3 %	31,6 %
	3,0–3,9 см	27,7 %	17,5 %
	≥ 4 см	10,6 %	10,5 %

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft, Inc., США). Данные представляли в виде Ме (С25-С75) (где Ме - медиана, С25 и С75 – интерквартильный размах в виде 25-й и 75-й процентилей).

Результаты и обсуждение

Основные клинико-морфологические особенности РМП оценивались по следующим показателям: степень дифференцировки опухоли (G), количество выявленных очагов опухолевого роста, локализация новообразования в мочевом пузыре и линейный размер опухоли (табл. 1). Проведенный анализ клинических и патоморфологических характеристик уротелиальной карциномы не выявил статистически значимых различий по распределению частот между сравниваемыми группами больных РМП.

Анализ фенотипических особенностей клеток осадка мочи у пациентов с неинвазивным РМП выявил значимое повышение относительного содержания в осадке мочи клеток, экспрессирующих поверхностный антиген CD13, по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 2). Кроме того, в группе больных с неинвазивным РМП обнаружено увеличение в осадке мочи в 4,8 раза (р<0,001) клеток, экспрессирующих поверхностный антиген CD15, и в 4,9 раза (р<0,001) клеток, экспрессирующих антиген CD45.

CD45 является общим лейкоцитарным антигеном. Содержание лейкоцитов в клеточном осадке мочи повышается при различных заболеваниях мочеполовой системы, в том числе и при злокачественных новообразованиях. Однако данный показатель характеризуется низкой специфичностью по отношению к заболеванию. По имеющимся данным литературы [2], CD13 экспрессируется на поверхности клеток подслизистого слоя мочевого пузыря. Кроме того, данный маркер фиксируется на поверхности клеток, развивающихся из эктодермального зародышевого листка – нервной ткани и лимфы. Превышение CD13+-клеток в группе пациентов с РМП по сравнению с относительно здоровыми донорами является свидетельством того, что в патологический процесс вовлечены не только клетки поверхностного эпителия. При этом на начальных этапах развития РМП в канце- рогенез вовлекаются только поверхностные слои тканей органа. При распространении процесса на подслизистый слой часть клеток с определяемым поверхностным антигеном переносится в жидкую фазу и аккумулируется в клеточном осадке. LewisX-антиген, или CD15, является углеводной молекулой адгезии на поверхности активно делящихся клеток. Значительное содержание CD15+-клеток в осадке мочи свидетельствует о том, что патология сопровождается ростом пролиферативной активности клеток и нарушением межклеточного взаимодействия. Известно, что экспрессия генов, участвующих в синтезе данного рецептора, активизируется при РМП. Это также приводит к накоплению продукта данных генов.

Учитывая, что в большинстве случаев неинвазивного РМП отмечается рецидив опухолей после комбинированного лечения, значительный интерес представляет изучение зависимости уровня экспрессии поверхностных маркеров клеток осадка мочи от развития рецидива заболевания.

Результаты исследования установили повышение содержания в клеточном осадке мочи в 1-й группе больных РМП (с рецидивом заболевания), клеток, экспрессирующих поверхностный антиген CD13 (р<0,05) и антиген CD45 (р<0,01), относительно показателей, зарегистрированных во 2-й группе пациентов (без рецидива РМП). При этом количество клеток в осадке мочи, экспрессирующих поверхностный антиген CD15 в сравниваемых группах больных, не имело статистически значимых различий (табл. 3).

Отсутствие статистически значимых различий в количестве CD15+-клеток в осадке мочи у пациентов с развитием рецидива заболевания можно объяснить отсутствием принципиальной разницы в пролиферативной активности рецидивирующих и нерецидивирующих опухолей. Большее количество CD 13+-клеток в группе пациентов с развитием рецидива РМП отражает глубину поражения органа. Очевидно, что при более глубокой инвазии опухоли в подслизистый слой мочевого пузыря возникает большая вероятность нерадикального выполнения ТУР и последующего рецидива.

Обращает на себя внимание интересная особенность в группе больных с рецидивом РМП: большее содержание лейкоцитов в моче относительно группы пациентов без рецидива заболе-

Таблица 2

Показатель	Контрольная группа              Больные РМП (n=47)                           (n=85)                         р Me (С25-С75)                 Me (С25-С75)
Количество CD13 ' клеток Количество CD15 ' клеток Количество CD45 ' клеток	1,90 (1,10–2,80) %               3,70 (1,60–8,20) %                 р<0,05 1,30 (0,70–3,70) %               6,20 (2,80–14,1) %                р<0,001 0,85 (0,30–4,00) %               4,20 (1,80–8,00) %                р<0,001

Примечание: р – уровень статистических различий по сравнению с показателями контрольной группы.

Таблица 3

Уровни экспрессии поверхностных антигенов на клетках осадка мочи у больных неинвазивным раком мочевого пузыря

Показатель	1-й группа                      2-й группа (n=46)                           (n=39)                         р Me (С25-С75)                 Me (С25-С75)
Количество CD13 ' клеток Количество CD15 ' клеток Количество CD45 ' клеток	4,10 (3,00–8,10) %               2,60 (1,70–4,30) %                р<0,05 5,40 (4,10–12,30) %              5,95 (2,40–13,30) %                р>0,05 6,10 (4,00–7,90) %               2,70 (1,90–6,00) %                р<0,01

Примечание: р – уровень статистических различий по сравнению с показателями контрольной группы.

Уровни экспрессии поверхностных антигенов на клетках осадка мочи

вания. Можно предположить, что особенностью рецидивирующих опухолей является способность их ухода из-под иммунологического надзора.

Заключение

Отсутствие значимых различий клиникоморфологических параметров в группах пациентов с различным течением неинвазивного рака мочевого пузыря свидетельствует о том, что развитие рецидива заболевания опосредуется индивидуальными биологическими особенностями уротелиальной карциномы. Выявленные различия демонстрируют особенности развития уротелиальной карциномы на ранних этапах канцерогенеза. Повышение содержания CD13+-клеток в осадке мочи может отражать воздействие растущего злокачественного новообразования на ткани подслизистого слоя органа. Увеличение поверхностных молекул адгезии и косвенное подтверждение наличия интенсивных процессов, ассоциированных с клеточным делением за счет увеличения относи- тельного содержания CD 15+-клеток в осадке мочи, свидетельствует о злокачественном потенциале обнаруженных изменений. Данное наблюдение подтверждает и выявленное увеличение в клеточном осадке мочи доли клеток иммунной системы, экспрессирующих CD45.