Ферментативный гидролиз кератинсодержащего сырья

Современная мясная промышленность охватывает решение целого ряда актуальных задач, прежде всего связанных с восполнением недостатка пищевого и кормового белка в мировом производстве, разработкой и внедрением способов рационального и максимального использования вторичного сырья переработки скота, птицы и мяса, в том числе промышленных кератинсодержащих продуктов [1, 2]. Привлекательность последних состоит, прежде всего, в полноценности аминокислотного состава белков, массовая доля которых находится в пределах 70-98%. Однако сдерживающим фактором являются низкая перевариваемость и усвоение, связанные со специфической упрочненной структурой и наличием значительного числа межцепочечных дисульфидных связей [3].

Рост объемов производства птицеперерабатывающей промышленности и устойчивая тенденция ее дальнейшего развития в мире и у нас в стране обусловливают скопление значительных объемов пера, переход на переработку бройлеров и внедрение механизированных систем приводит к резкому снижению объемов пера, используемого в традиционных направлениях.

В настоящее время остро стоит задача обогащения функциональными ингредиентами пищевых и кормовых продуктов. С целью повышения функционально-технологических свойств и снижения себестоимости продукции предприятия мясной промышленности стали активно использовать белки растительного и животного происхождения. Однако недостатки растительных белков известны и связаны, главным образом, с наличием лимитирующих биологическую ценность аминокислот и ограничениями по органолептическим свойствам. Ассортимент белков животного происхождения достаточно широк и базируется на источниках: кровь промышленных животных, соединительная ткань, молоко и молочная сыворотка и другие [1]. Экономическая целесообразность и аминокислотный состав кератиновых белков позволяют положительно оценить перспективы использования этих малоценных вторичных продуктов мясной отрасли.

В этой связи изыскание путей рациональной переработки и использования кератинсодержащего сырья имеет важное народнохозяйственное значение. В этом сырье содержится до 85% белка при практически полном наборе аминокислот. Организация и совершенствование технологических процессов переработки кератинсодержащего сырья в продукты пищевого, технического и специального назначения тесно связаны со способами их получения. Анализ биохимического состава кератинсодержащего сырья в процессе его переработки в состоянии оказать существенную помощь как в сознательном научно обоснованном управлении отдельными технологическими приемами, так и в обеспечении экологичности производства за счет создания безотходных и малоотходных технологий при максимальном вовлечении побочных продуктов переработки в основное производство.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным является проведение ферментативной обработки кератинсодержащего сырья с целью получения пищевых добавок.

Используемые для этой цели протеолитические ферменты класса гидролаз содержатся во всех живых организмах, катализируя гидролиз пептидных связей различных клеточных белков. Препараты протеолитических ферментов применяют в лабораториях (для установления строения белков и пептидов), в пищевой промышленности и в медицине [4].

В решении вопроса подбора протеаз в производстве пищевого продукта важное значение имеют их специфичность к определенной пептидной связи гидролизуемого белка, а также активность и стабильность протеаз как функции рН и температуры, присутствие активаторов и ингибиторов, стоимость и возможность приобретения препарата. Учет этих критериев дает возможность оценки различных по специфичности протеаз при их использовании в пищевой промышленности. Как правило, для производства белковых гидролизатов из кератинсодержащего сырья требуется применение ферментов, обладающих широкой специфичностью, что обеспечивает глубокий гидролиз белков упроченной структуры до низкомолекулярных пептидов и аминокислот.

Определяющим фактором для целенаправленного использования этих добавок является состав продуктов ферментативного гидролиза сырья. Компонентный состав получаемых гидролизатов существенно зависит от условий предварительной обработки и выбора ферментного препарата.

С целью направленного выбора ферментов для модификации кератинсодержащего сырья применяли следующие отечественные и импортные препараты протеолитического действия: протосубтилин Г 3х, коллагеназу, мегатерин Г 10х, протеазу «С», амилопротооризин Г 10х и «Савиназу», характеристика свойств которых дана в таблице 1. Ферментные препараты выбирали по оптимальному значению рН для проявления их активности, совпадающему с диапазоном растворов кератинового сырья (рН 7-9).

Таблица 1

Физико-химические характеристики ферментных препаратов

Протеолитические ферментные препараты	Оптимальное значение рН	Оптимальное значение температуры, оС
Протосубтилин Г 3х	7,2-7,6	40
Коллагеназа	7,2-7,4	40
Мегатерин Г 10х	7,4-7,6	40
Протеаза «С»	10,0	50
Амилопротооризин Г 10х	5,0-5,5	50
Савиназа	10,0	50

В качестве субстрата использовали предварительно обработанное кератинсодержащее сырье при температуре 1200С в течение 30 минут (гидромодуль 1:20) с целью денатурации белка кератина. Ферментные препараты вносили в соответствии с характеристикой препаратов в концентрации 60 ед активности на 1 г белка субстрата, обеспечивающей его максимальный гидролиз. В процессе ферментативного гидролиза определяли содержание общего азота с помощью анализатора белка RAPID N ELEMENTAR, содержание общего белка рассчитывали умножением общего азота на пересчетный коэффициент для белков (составляющий 6,25), пептидов и аминокислот на аминокислотном анализаторе «ARACUS» методом распределительной хроматографии и аминокислоты тирозина при разрыве боковых связей, образованных ее фенольным кольцом (реакция Фолина на тирозиновые и цистеиновые радикалы) и редуцирующие вещества [3, 4].

После предварительной обработки кератинсодержащего сырья в растворе фиксировали (рис. 1): растворимый белок - 1,1 мг/см3, суммарные пептиды и аминокислоты – 60 мкг/см3, тирозин – 0,2 мкмоль/см3 и редуцирующие вещества – 35 мкг/см3. Доля растворенного продукта – 5,2 мас.% сырья. Следует отметить, что предварительная обработка кератинсодержащего сырья не приводила к его значительному растворению. Для более глубокой деструкции после предварительной обработки в среду вносили ферментные препараты в виде водных растворов.

Ферментативный гидролиз проводили в течение 6 ч при оптимальных условиях действия ферментов.

На основании проведенных результатов исследований сделаны следующие выводы: максимальная растворимость кератинсодержащего сырья отмечена при использовании «Савиназы» (41,5%) и протеазы «С» (42,4 %). Данный показатель имеет важное значение при массовой промышленной переработке кератина с целью более полной утилизации сырья. Дальнейшая обработка кератинсодержащего сырья с ферментными препаратами не приводила к ощутимым результатам: после 6 часов гидролиза массовая доля растворимого белка повысилась всего на 1-2 %.

К 1     2     3 а 4     5     6

1,5

К123456

г

Рис. 1. Сравнительный гидролиз кератинсодержащего сырья различными препаратами: К-до гидролиза; 1 – Савиназа; 2 – Протосубтилин Г 3х; 3 – Коллагеназа; 4 – Мегатерин Г 10х; 5 – Протеаза «С»; 6 – Амилопротооризин Г 10х

После действия коллагеназы и амилопротооризина Г 10х отмечены самые низкие показатели растворимого белка – не более 3,2 мг/см3. Применение мегатерина, протосубтилина Г 3х и протеазы «С» на 25-50 % повышает данный показатель. При действии препарата «Савиназа» массовая доля растворимого белка увеличилась почти в 5 раз по сравнению с исходным значением и составила к концу гидролиза 5,2 мг/см3, что превышает аналогичные показатели для всех остальных препаратов.

Содержание пептидов и аминокислот в исследуемой смеси увеличилось с 60 до 1498 мкг/см3 для некоторых препаратов и максимально – для коллагеназы – 2669 мкг/см3, что подчеркивает специфичность ее эффективного действия по отношению к исследуемому сырью. Очевидно, параллельно с образованием растворимого белка происходил процесс его дальнейшего гидролиза до низкомолекулярных веществ. К концу гидролиза действие всех ферментных препаратов ослабевало в связи с ограничением их специфической активности в отношении кератина.

Повышение массовой доли аминокислоты тирозина с 0,2 до 1,1 мкмоль/см3 во всех случаях может свидетельствовать об изменениях во вторичной структуре белка – разрыве связей в боковых радикалах, освобождении фенольного кольца аминокислоты тирозина и его окрашивании реактивом Фолина [5, 6].

Таким образом, результаты ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья свидетельствуют, что для получения белковых добавок целесообразно использоать ферментные препараты протеолитического действия. В зависимости от целевого использования белковых пищевых добавок необходимо руководствоваться выбором ферментных препаратов для гидролиза. Для увеличения функционально-технологических свойств пищевого сырья обосновано внесение гидролизата, полученного с помощью ферментного препарата «Савиназа» (большее содержание растворимого белка – 5,2 мг/см3 и меньшее низкомолекулярных веществ – 852 мкг/ см3). Для сбалансированности химического состава и увеличения биологической ценности предпочтительно внесение гидролизата, полученного обработкой ферментным препаратом коллагеназой (меньшее содержание растворимого белка – 3,2 мг/см3 и повышенное содержание пептидов и аминокислот – 2759 мкг/ см3).

Увеличение потребности в белковых продуктах на перспективу и необходимость обеспечения рационального питания приводят к возникновению и быстрому развитию качественно новых направлений в производстве пищи [1, 7]. Это направление включает получение комбинированных и искусственных продуктов на основе значительных потенциальных ресурсов пищевого белка с учетом строжайшей экономии природных и модифицированных животных белков [8].

Комбинирование белковых добавок животного происхождения с кератиновым ферментативным гидролизатом позволяет обогатить конечные продукты пептидами и аминокислотами и сократить расход животных белков в рецептурах продуктов пищевого и кормового назначения. На основе полученных результатов разработаны технологические схемы получения продуктов на основе кератиновых гидролизатов.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», государственный контракт №16.740.11.0058