Филогенетическое разнообразие бактерий, выделенных из ризосферы мари красной (Chenopodium rubrum L.), произрастающей в условиях засоления на территории солеразработок (г. Соликамск, Пермский край)

Засоление почвы является очень важным экологическим фактором из-за его сильного воздействия на продуктивность растений, достаточно широкой распространенности и тенденции к расширению площади почв с увеличенной минерализацией, в том числе и вследствие антропогенного воздействия. Однако, несмотря на рост количества работ по изучению биоразнообразия бактерий засоленных почв и увеличивающийся интерес к галофиль-ным микроорганизмам в связи с их потенциальной важностью для биотехнологии, микробные сообщества данных почв остаются недостаточно изученными. Особенно слабо исследовано биоразнообразие бактерий ризосферы растений, произрастающих на засоленных почвах.

На территории Пермского края засоление почв носит техногенный характер и обусловлено, прежде всего, добычей солей на Верхнекамском месторождении. При промышленной добыче и переработке солей этого месторождения на поверхности складируются отходы производства в шламохрани-лищах и галитовых отвалах, содержание хлорида натрия в которых составляет более 90% [Бабошко, Бачурин, 2009]. Растворение материала отвалов и вынос солей приводят к появлению зон засоления, а в понижениях, прилегающих к подножью, образуются озера с соленой водой (рассолосборники), в которых происходит осаждение солей [Шубин, 2005]. Таким образом, на территории солеразработок формируются местообитания для бактерий, устойчивых к высокой минерализации среды.

Целью настоящей работы было изучение бактериального сообщества ризосферы растений вида марь красная ( Chenopodium rubrum L.), которые преобладали в травяном покрове на наиболее засоленных участках территории района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей в (г. Соликамск, Пермский край).

Материалы и методы исследования

В качестве материалов исследования были отобраны почвенные образцы с трех участков, расположенных в районе разработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей Пермского края в окрестностях г. Соликамска, Россия. Участки

расположены в непосредственной близости от двух солеотвалов ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск) и имеют засоленную почву. Образцы ризосферы растений мари красной ( Chenopodium rubrum L.) отбирались с использованием стандартных методов [Методы почвенной …, 1991].

Определение содержания катионов Na+ осуществляли из водной вытяжки, приготовленной согласно ГОСТу 26423-85, с последующей их детекцией на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА-6300 (“Shimadzu”, Япония), сотрудниками группы физико-химических исследований ИЭГМ УрО РАН.

В работе использовали богатую среду Раймон-да/БСР (г/л): NH4NO3 – 2, MgSO4 x 7H2O – 0.2, KH2PO4 – 2, Na2HPO4 – 3, Na2CO3 – 0.1, CaCl2 x 6H2O – 0.01 с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта [Raymond, 1964]. NaCl вносили в среду до конечной концентрации 50 г/л. Для получения агаризованных сред вносили агар («Sigma», США) 15 г/л. Микробиологический анализ ризосферы растений проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на ага-ризованную среду с последующим подсчетом колоний микроорганизмов (колонии образующих единиц, КОЕ) и выделением бактерий из единичных колоний для идентификации [Методы почвенной …, 1991].

Для выделения галофильных штаммов бактерий был использован метод накопительного культивирования на БСР с содержанием NaCl 150 г/л. Образцы ризосферы весом 1 г были помещены в 250 мл колбы с 100 мл БСР с содержанием NaCl 150 г/л. Инкубацию проводили в течение 2 недель на термокачалке (100 об/мин.) при температуре

282^8. Из накопительных культур путем высева на агаризованную БСР (концентрация соли составляла 150 г/л) выделяли чистые культуры микроорганизмов.

Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров прямого 27F и обратного 1492R согласно описанной методике [Молекулярная генетика, 2007].

Филогенетический анализ полученных изолятов был основан на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете. Полученные нуклеотидные последовательности длиной около 800 пн были проанализированы с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner v1.0. Поиск гомологичных последовательностей проводили по базам данных GenBank и EzTaxon .

Результаты и обсуждение

Методом прямого высева на агаризованную БСР с содержанием NaCl 50 г/л из образцов ризосферы, отобранных из района солеразработок ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск), было выделено 14 морфотипов бактерий, отличающихся морфологическими признаками (табл. 1). Отмечено негативное влияние засоления почвы на численность бактерий в ризосфере. Так, общая численность бактерий в ризосферной зоне растений, произрастающих на почве с содержанием Na+ – 5.18 и 1.24 мг-экв/100 г общая численность бактерий была меньше, чем на почве с концентрацией Na+ – 0.56 мг-экв/100 г в 5,2 и 18,0 раз, соответственно.

Таблица 1

Штаммы бактерий, выделенные из ризосферы мари красной, произрастающей на территории солеразработок ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск)

S к 5 О g	сЗ & ко 5 s.	1 Е	Штаммы, выделенные на БСР, 50 г/л NaCl	Описание морфологии колоний (морфотип)	---■----- II и
1	10 м от со-леот-вала СКПРУ-2	5 0.56	M105-1	Бледно-желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм	2 ^ 10 6
			M106-5	Красно-оранжевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 3 мм	1 ^ 10 7
			M107-2	Желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм	1 ^ 10 7
			M107-4	Темно-белая, круглая, складчатая, матовая, профиль плоский, край ровный, структура мелкозернистая, 8 мм	5 ^ 10 7
2	5 м от со-леот-вала СКПРУ-2	5.18	M115-1	Бело-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль каплевидный, край ровный, структура однородная, 1 мм	2 ^ 10 5
			M115-3N-a	Бежевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 5 мм	1.5 1 10 6
			M116-2	Желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 1,5 мм	4 1 10 6
			M116-3	Бежевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 6 мм	4 1 10 6

Окончание табл. 1

s и 5 О ч с £	>и И и И сЗ & О ю о о	со И И «и ИИ И’Д ИИ ы	Штаммы, выделенные на БСР, 50 г/л NaCl	Описание морфологии колоний (морфотип)	to g и о S
			M116-4	Светло-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 3 мм	1 ^ 10 6
			M116-7	Светло-оранжевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 1 мм	2 ^ 10 6
			M116-8	Светло-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 2,5 мм	132 10 6
3	10 м от со-леот-вала СКПРУ-1	1.24	M136-2	Темно-белая, круглая, гладкая, матовая, профиль выпуклый, край зубчатый, структура однородная, 2 мм	1 ^ 10 6
			M136-3	Светло-желтая, круглая, гладкая, матовая, профиль выпуклый, край зубчатый, структура однородная, 1,5 мм	1 3 10 6
			M136-7	Темно-желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм	2 3 10 6

Методом накопительного культивирования на БСР с содержанием соли 150 г/л был изолирован единственный штамм MH13R2-2 из образца ризосферы (Na+1.24 мг-экв/100 г), отобранного на расстоянии 10 м от солеотвала СКПРУ-1. Данный штамм был представлен бесцветными блестящими прозрачными колониями округлой формы, размером 1–2 мм, с гладкой поверхностью, плоским профилем, ровным краем и однородной структурой.

У изолированных штаммов были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК (табл. 2). Установлено, что исследуемые бактерии принадлежат классам Gammaproteo bacteria филума Proteobacteria (рода Salinicola,

Kushneria, Halomonas, Marinobacter, Idiomarina) , Actinobacteria филума Actinobacteria (рода Isoptericola, Microbacterium, Salinibacterium ), Bacilli филума Firmicutes (рода Bacillus, Planomicrobium) и Flavobacteriia филума Bacteroidetes (род Salegentibacter . При этом подавляющее большинство типовых штаммов бактерий, к которым наиболее близки по нуклеотидным последовательностям фрагмента гена 16S рРНК выделенные штаммы, являются галотолерантными или гало-фильными бактериями. Исключение составляет Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468^T, обитающий на поверхности побегов злаковых растений [Behrendt, Ulrich, Schumann, 2001].

Таблица 2

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных бактерий

Штамм	Идентификация на основе анализа гена 16S рРНК
	Типовой штамм	№ GenBank	Сходство, %	Количество нуклеотидов
M105-1	Salinicola salarius M27T	AM229316	99.3	1346
M106-5	Kushneria marisflavi SW32T	AF251143	98.6	1386
M107-2	Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468T	AJ277840	100	764
M107-4	Bacillus safensis FO-036bT	AF234854	99.9	834
M115-1	Bacillus hwajinpoensis SW-72T	AF541966	99.7	782
M115-3Na	Halomonas titanicae BH1T	FN433898	98.9	1405
M116-2	Microbacterium terricola KV-448T	AB234025	98.8	1294
M116-3	Halomonas taeanensis BH539T	AY671975	99.3	1377
M116-4	Planomicrobium flavidum ISL-41T	FJ265708	99.1	736
M116-7	Salegentibacter salarius ISL-6T	EF486353	99.1	789
M116-8	Marinobacter maritimus CK47T	AJ704395	97.8	1343
M136-2	Isoptericola chiayiensis 06182M-1T	FJ469988	99.1	1291
M136-3	Isoptericola halotolerans YIM 70177T	AY789835	99.2	779
M136-7	Salinibacterium amurskyense KMM 3673T	AF539697	99.8	863
MH13R2-2	Idiomarina loihiensis L2TRT	AF288370	100	833

Заключение

В ризосфере растений, произрастающих на площадке № 1, доля выделенных бактерий, относящихся к классу Gammaproteobacteria, составляла 16.7% общей численности, на площадках 2 и 3 – 47.4 и 50.0%, соответственно. Для выделенных бактерий, принадлежащих к классу Actinobacteria, данный показатель составлял 13.9, 29.2 и 50.0%, соответственно. Бактерии класса Bacilli были выделены из ризосферы растений с площадок № 1 и 2, доля данных бактерий составляла 69.4 и 8.8%, соответственно. Из ризосферы растений участка № 2 были выделены бактерии, относящиеся к классу Flavobacteriia, доля от общей численности которых была 14.6%.

Известно, что в ризосфере растений гумидного климата доминируют бактерии рода Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria) , кроме того, для ризосферной зоны типичны бактерии родов Agrobacterium (класс      Alphaproteobacteria ) ,

Xanthomonas (класс Gammaproteobacteria) и Flavobacterium (класс Flavobacteriia) [Звягинцев, Добровольская, Лысак, 1993], при этом доля бацилл и актиномицетов невысока и составляет обычно около 1% [Юрчак, Утеуш, Омельченко, 1977; Калакуцкий, Шарая, 1990]. Высокая численность бактерий, принадлежащих к классам Actinobacteria и Bacilli, отмечена для ризосферы растений, произрастающих в пустынях, при этом доля данных бактерий возрастет в течение сухих периодов [Marasco et al., 2012; Kavamura et al., 2013].

Таким образом, установлено, что техногенное засоление почвы в окрестностях г. Соликамска оказывает сильное влияние на микробное сообщество ризосферной зоны растений вида марь красная ( Chenopodium rubrum L.), приводящее к развитию галотолерантных и галофильных бактерий, а также в увеличении доли бактерий классов Actinobacteria и Bacilli в ризосферной зоне. Отмечено негативное влияние засоления почвы на численность бактерий в ризосфере.

Работа поддержана грантом РФФИ Урал № 1304-96048 «Изучение механизмов функционирования микробно-растительных систем в условиях засоления почвы».