Физико-химические параметры эритроцитов крыс с сахарным диабетом I типа до и после курсового перорального введения наноструктурированного комплекса "хитозан-инсулин-наночастицы золота"

В настоящее время сахарный диабет является одной из важнейших медицинских и социальных проблем в мире, что обусловлено неизлечимым те- чением болезни и возникновением различных осложнений [Смолянский, Лифляндский, 2004].

Основным методом заместительной терапии

сахарного диабета I типа является регулярное инъекционное введение инсулина. Данный способ обладает существенными недостатками: сложность соблюдения больным режима и схемы лечения, боли и дискомфорт от постоянных инъекций.

Пероральный путь доставки инсулина является самым удобным для пациентов. Однако он требует наличия сложных и наукоемких препаратов из-за нестабильности белков в условиях желудочнокишечного тракта [Damge, Reis, Maincent, 2008; Зу-баеров, Ларионова, 2009]. Для стабилизации инсулина в этих условиях возможно использование нанокомпозитов «хитозан-золото» [Корягин и др., 2012].

Эритроциты претерпевают серьезные изменения структуры и функций при сахарном диабете, которые во многом определяют тяжесть течения заболевания и могут быть использованы для диагностики тяжести патологии и контроля эффективности лечения.

Цель работы – исследование сахаропонижающей активности комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» при однократном пероральном введении в условиях моделирования сахарного диабета I типа у крыс, и анализ некоторых физико-химических параметров эритроцитов животных с сахарным диабетом до и после курсового перорального введения комплекса.

Материалы и методы исследования

Материалы

Объектом исследования являлись белые беспородные крысы-самки половозрелого возраста массой 180–200 г.

Было проведено две серии экспериментов.

В первой серии исследовали влияние комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» на концентрацию глюкозы в крови крыс с сахарным диабетом I типа при однократном пероральном введении препарата.

Во второй серии исследований изучали действие курсового перорального введения комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» (курса заместительной терапии) на некоторые физикохимические параметры эритроцитов крови крыс с сахарным диабетом I типа (содержание гемоглобина и его гликированной фракции в эритроцитах, средний объем, упругость клеток, липидный состав и состояние свободнорадикального окисления в эритроцитах). Сахарный диабет у крыс вызывали однократным внутримышечным введением животным аллоксана в количестве 100 мг/кг массы. Патология развивалась не ранее чем через 5 сут. после инъекции.

Наноструктурированный комплекс «хитозан-инсулин-наночастицы золота» синтезирован на кафедре высокомолекулярных соединений и кол- лоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского и предоставлен профессором кафедры Л.А. Смирновой.

Животные первой серии были разделены на 3 экспериментальные группы по 5 крыс в каждой: 1я – интактные животные без каких-либо воздействий, 2-я – животные с аллоксановым сахарным диабетом после однократного перорального введения наноструктурированного комплекса «хитозан-наночастицы золота» (контроль), 3-я – крысы с сахарным диабетом после однократного перорального введения наноструктурированного комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» (опыт).

В первой серии опытов комплекс «хитозан-инсулин-наночастицы золота» вводили однократно через рот при помощи зонда в объеме 1 мл на животное, что соответствовало дозам: хитозан – 100 мг/кг, золото – 0.25 мг/кг, инсулин – 50 МЕ/кг массы. Контрольным животным вводили комплекс «хитозан-наночастицы золота». Кровь для оценки концентрации глюкозы забирали из хвостовой вены через 1, 2, 3, 6, 24 ч. после введения комплекса.

Во второй экспериментальной серии животные были разделены на 4 экспериментальные группы по 5 животных в каждой. 1-я – интактные животные, 2-я – контрольные животные с аллоксановым сахарным диабетом без терапии, 3-я – крысы с сахарным диабетом после курсового перорального введения наноструктурированного комплекса «хи-тозан-наночастицы золота» (плацебо), 4-я – крысы с сахарным диабетом после курсового перорального введения наноструктурированного комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» (опыт, заместительная терапия).

Через 10 сут. после начала моделирования диабета крысам 3-й и 4-й групп в течение 10 дней с периодичностью 1 раз в сутки перорально вводили наноструктурированные комплексы «хитозан-на-ночастицы золота» и «хитозан-инсулин-наночасти-цы золота», соответственно, в том же объеме и в тех же дозах, что и в предыдущей серии. На следующие сутки после окончания проведения курса заместительной терапии у животных из подъязычной вены брали кровь для анализа.

Экспериментальные работы были выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.

Материалом исследования служила цельная кровь, стабилизированная ЭДТА-К3, плазма и гемолизат эритроцитов.

Плазму получали центрифугированием цельной крови при 3000 об/мин. в течение 15 мин. при комнатной температуре. Эритроциты дважды от- мывали физиологическим раствором, гемолизат получали путем замораживания и оттаивания суспензии.

Методы исследования

Эритроцитарные индексы крови крыс оценивали с помощью гематологического анализатора Abacus Junior.

Концентрацию глюкозы в образцах крови определяли с помощью глюкозооксидазного метода с использованием набора реагентов «Глюкоза ДДС», гликированного гемоглобина – методом аффинной хроматографии с использованием набора реагентов «Гликогемотест».

Оценку состояния процессов свободнорадикального окисления и активности антиоксидантной системы защиты в эритроцитах крыс проводили, используя метод Fe2+-индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) на биохемилюминометре Lum-100. Определяли два параметра: 1) интенсивность свободнорадикального окисления (I max), характеризующую количество свободных радикалов в пробе; 2) светосумму хемилюминесценции (S) – величину, обратную общей антиоксидантной активности пробы, характеризующую способность данного субстрата тормозить реакции окисления [Кузьмина, Нелюбин, Щенникова, 1983].

Липидный состав эритроцитов анализировали методом тонкослойной хроматографии. Липиды экстрагировали с использованием метода Фолча с модификациями. Липиды фракционировали последовательно в двух системах растворителей: хлоро-форм-метанол-вода-н-гептан (65 : 25 : 4:9) (фракционирование фосфолипидов), а затем в системе н-гептан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (95 : 4:1) (фракционирование нейтральных липидов). Для качественного анализа хроматограммы обрабатывали 10%-ным раствором фосфорномолибде-новой кислоты в этаноле и нагревали [Шаршунова, Шварц, Михалец, 1980]. Для количественной оценки содержания отдельных фракций липидов пластинки сканировали. Затем при использовании программы ONE-Dscan оценивали относительное содержание каждой фракции (выражали в процентах от суммы липидов).

Упругость эритроцитов определяли с помощью акустического анализатора «БИОМ». Акустический анализатор проводит последовательное измерение резонансных частот акустических ячеек с цельной кровью и плазмой, выражает связь между этими характеристиками через акустический параметр (АКП), определяет скорость и поглощение ультразвука компонентом исследуемой среды [Клемина и др., 2014]. Этот метод дает возможность в течение нескольких минут получить данные о структурных характеристиках биообразцов [Гурбатов и др., 2009].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием двух критериев для множественных сравнений: критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони и критерия Крускала-Уоллиса (для статистической обработки показателей активности свободнорадикального окисления и липидного профиля эритроцитов экспериментальных животных) [Гланц, 1998].

Результаты и их обсуждение

Введение крысам аллоксана в количестве 100 мг/кг массы спустя 5 сут. приводило к резкому увеличению содержания глюкозы в крови (> 20 ммоль/л), что свидетельствовало о нарушении продукции инсулина и достаточно тяжелом течении заболевания.

После однократного перорального введения экспериментальным животным с сахарным диабетом наноструктурированного комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» содержание глюкозы снижалось относительно этого же показателя у контрольных животных (рис. 1). Максимальное снижение содержания глюкозы в крови наблюдали через 2–3 ч. после введения комплекса, через 6 ч. содержание глюкозы в крови постепенно увеличивалось, достигая максимальных значений к 24 ч. после введения препарата. Однако, показатель содержания глюкозы в крови крыс после введения наноструктурированного комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» не достигал критических значений исходного уровня (рис. 1).

Рис. 1 . Изменение концентрации глюкозы в крови крыс с сахарным диабетом в течение суток после однократного перорального введения комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота»

Результаты этой серии исследований позволяют заключить, что инсулин в составе наноструктури-рованного комплекса «хитозан-инсулин-наночас-тицы золота» частично защищен от разрушающего действия протеаз, проникает из полости кишечника в кровь и в течение нескольких часов проявляет свою сахаропонижающую активность.

Выявленные эффекты послужили основанием для изучения терапевтической эффективности комплекса при его курсовом пероральном применении.

После курсового введения препарата «хитозан-инсулин-наночастицы золота» концентрация глюкозы в крови крыс с сахарным диабетом была также меньше по сравнению с таковой у животных без проводимой терапии (контроль), но не достигала уровня интактных животных (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация глюкозы в крови крыс с сахарным диабетом до и после курсового введения комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота».

* – p< 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p <0.05 по сравнению с контролем

У крыс с аллоксановым сахарным диабетом гипергликемия сопровождалась значительным увеличением содержания гликированного гемоглобина в крови (рис. 3). Содержание гликированного гемоглобина в крови экспериментальных животных после курса заместительной терапии наност-руктурированным комплексом с инсулином значимо (p<0.05) снижалось по сравнению с контролем. После введения крысам комплекса «хитозан-наночастицы золота» показатели содержания глюкозы и гликированного гемоглобина крови не от-

гемоглобина в крови крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной терапии и интактных животных.

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p< 0.05 по сравнению с контролем

Полученные результаты свидетельствуют о наличии положительного эффекта от перорального введения животным комплекса с инсулином и позволяют предположить наличие структурнофункциональных перестроек эритроцитов у крыс с сахарным диабетом до лечения и их частичную коррекцию после проводимой терапии.

У крыс с сахарным диабетом до лечения происходило снижение среднего объема эритроцитов (MCV) и уменьшение содержания гемоглобина в эритроците (MCH) (рис. 4, 5). После курсового перорального введения крысам с сахарным диабетом комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» средний объем клеток и содержание гемоглобина в эритроците не отличались от таковых у интактных животных. Курсовое введение экспериментальным животным с сахарным диабетом комплекса «хито-зан-наночастицы золота» не оказывало подобного влияния.

Рис. 4 . Средний объем эритроцитов (MCV) крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной терапии и у интактных животных.

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p < 0.05 по сравнению с контролем

Рис. 5. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) крыс с сахарным диабе– том до и после курса заместительной тера- пии и у интактных животных.

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p < 0.05 по сравнению с контролем

Количество гемоглобина в эритроцитах определяет вязко-эластичные свойства клеток. Снижение содержания гемоглобина в эритроцитах может приводить к повышению деформируемости клеток [Новицкий, Гольдберг, Уразова, 2009].

В представленной работе акустическим методом обнаружено уменьшение упругости эритроцитов в крови животных с сахарным диабетом до лечения относительно интактных крыс (рис. 6). Полученные изменения могут быть связаны с уменьшением концентрации гемоглобина в эритроците и уменьшением объема клеток.

Рис. 6 . Упругость (G) эритроцитов крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной терапии и у интактных животных.

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p< 0.05 по сравнению с контролем

После перорального введения крысам с сахарным диабетом комплекса «хитозан-нсулин-нано-частицы золота» упругость эритроцитов повышалась, акустический параметр клеток не отличался от такового у интактных животных. Такого выраженного корригирующего эффекта на упругость эритроцитов крыс с сахарным диабетом препарата «хитозан-наночастицы золота» не обнаружено.

Изменения физических параметров эритроцитов могут быть обусловлены не только внутриклеточной вязкостью, но и структурными особенностями мембраны эритроцитов.

При сахарном диабете происходит нарушение равновесия между свободнорадикальным окислением (СРО) и антиоксидантной активностью (АОА) в биологических средах и тканях организма. Сдвиг баланса СРО-АОА в сторону активации свободнорадикального окисления и накопления свободных радикалов в эритроцитах является причиной снижения в мембранах ненасыщенных липидов и, как следствие, снижения деформируемости клеток [Балаболкин, 2002].

В представленной работе в эритроцитах крыс с сахарным диабетом наблюдается выраженная тенденция к накоплению свободных радикалов (повышению Imax) и ингибированию активности антиоксидантной системы защиты (повышению S) по сравнению с интактными животными (рис. 7, 8). Введение животным с сахарным диабетом комплекса «хи-тозан-наночастицы золота» приводило к еще более выраженному увеличению количества свободных радикалов в эритроцитах и ингибированию антиокси- дантной системы по сравнению с показателями у ин- тактных животных.

Рис. 7 . Светосумма биохемилюминесценции в эритроцитах крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной терапии и у интактных животных.

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными

Рис. 8. Интенсивность биохемилюминесценции в эритроцитах крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной тера- пии и у интактных животных

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными

После курсового введения крысам нанострукту-рированного комплекса «хитозан-инсулин-нано-частицы золота» подобного эффекта не наблюдалось, показатели БХЛ не отличались от таковых у интактных животных.

Вязко-эластические свойства мембран эритроцитов во многом зависят от состава липидов. Вязкость мембраны меньше, если в составе липидов преобладают ненасыщенные фосфолипиды, например, фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэта-ноламин (ФЭА) и увеличивается при высоком содержании насыщенных фосфолипидов, примером которых является сфингомиелин (СМ), а также при накоплении в мембранах холестерола [Сруби-лин, Еникеев, 2012].

Изучение состава липидов эритроцитов крыс с сахарным диабетом до лечения показало, что в красных клетках крови происходит накопление сфингомиелина и уменьшение фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина по сравнению с показателями интактных животных (таблица). Лечение крыс с использованием комплекса «хитозан- инсулин-наночастицы золота» приводило к снижению содержания сфингомиелина и накоплению фосфатидилхолина в эритроцитах по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание этих фосфолипидов в эритроцитах животных с сахарным диабетом после лечения не отличалось от такового у интактных крыс, однако уровень ФЭА в эритроцитах оставался низким.

Относительное содержание отдельных фракций фосфолипидов в эритроцитах крыс с сахарным диабетом до и после курса заместительной терапии и у интактных животных

Группа животных	Относительное содержание отдельных фракций фосфолипидов, %
	СМ	ФХ	ЛФХ	ФЭА
Интактные	0.74	28.15	0.53	20.07
Контроль	2.15*	10.04*	0.70	13,00*
Хитозан-золото	1.02	10.86*	0.22	11.61*
Хитозан-золото-инсулин	0.43**	18.51**	0.25	14.61*

* – p < 0.05 по сравнению с интактными животными; ** – p< 0.05 по сравнению с контролем.

После введения крысам с сахарным диабетом комплекса «хитозан-наночастицы золота» не обнаружено такого выраженного корригирующего эффекта на состав фосфолипидов эритроцитов.

Уровень холестерола в эритроцитах крыс с сахарным диабетом как до лечения, так и после курсового введения комплексов «хитозан-наночастицы золота», «хитозан-наночастицы золо-та-инсулин» существенно не изменялся по сравнению с таковым у интактных животных.

Сдвиг баланса СРО-АОА в сторону накопления свободных радикалов, фосфолипидные перестройки эритроцитов крыс при сахарном диабете до и после проводимой терапии, позволяющие предположить увеличение вязкостных характеристик мембраны клеток до лечения и их коррекцию после курсового введения крысам препарата «хито-зан-наночастицы золота-инсулин», не сопровождались, соответственно, повышением упругости эритроцитов до лечения и снижением акустического параметра клеток после проводимой терапии. Таким образом, изменения вязко-эластичных свойств эритроцитов крыс при сахарном диабете были обусловлены в основном снижением содержания гемоглобина в клетках. Нормализация содержания гемоглобина в эритроцитах крыс с сахарным диабетом после проводимой терапии с инсулином сопровождалась восстановлением упругости клеток.

В настоящее время стремительный рост популяции больных сахарным диабетом в мире приводит к увеличению числа пациентов с диабетическим поражением почек. Хроническая болезнь почек является одной из ведущих причин анемии

[Мартынов и др., 2018]. В комплексной диагностике анемий при сахарном диабете возможным является использование акустического анализа упругости эритроцитов.

Заключение

Моделирование сахарного диабета I типа приводит к резкому повышению содержания глюкозы и гликированного гемоглобина в крови экспериментальных животных, а также структурнофункциональным перестройкам эритроцитов, регистрируемым биохимическими и акустическим методами.

Однократное пероральное введение препарата «хитозан-инсулин-наночастицы золота» значительно понижает концентрацию глюкозы в крови диабетических животных. Проведение курса заместительной терапии пероральным введением наноструктурированного комплекса «хитозан-инсулин-наночастицы золота» также приводит к снижению содержания глюкозы и гликированного гемоглобина в крови и обеспечивает коррекцию физико-химических показателей красных клеток крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом I типа.

В комплексной диагностике сахарного диабета – оценке наличия осложнений, тяжести течения патологии, эффективности проводимой терапии, возможно использование акустических методов исследования эритроцитов, позволяющих быстро и точно оценить изменения физических параметров клеток.

Авторы выражают искреннюю благодарность к.б.н., генеральному директору фирмы «БИОМ» В.А. Клемину за оказание консультативной помощи при проведении акустических исследований эритроцитов, а также д-ру хим. наук, профессору кафедры высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского Л.А. Смирновой за создание нанокомпозитов и возможность их использования в работе.