Физико-химические свойства имидазолидов, их мутагенность, и способность Drosophila melanogaster адаптироваться к ним

Обилие и разнообразие большого числа пестицидов привело к тому, что они стали важнейшим компонентом среды обитания. Не смотря на попытки создания пестицидов с избирательной токсичностью, все исследования показали, что они действуют на все компоненты биоты экосистем. В результате этого многие виды погибают, а у некоторых возникает устойчивость. Развитие устойчивости не обязательно ведет к увеличению общей приспособленности. Так в популяциях Blatella germanica , подвергнутых периодическому воздействию пиретроидов обнаружена кариотипическая нестабильность [12].

Применение одних и тех же пестицидов приводит к селекции по генам устойчивости к данному ксенобиотику, что побуждает искать новые эффективные пестициды.

Особый интерес представляют собой вещества, которые являются аналогами природных биологически активных веществ, так как они выступают как их конкуренты. К таким соединениям относятся различные производные имидазола.

Биологическая активность производных имидазола чрезвычайно высока. Наиболее распространенным производным имидазола является гистидин, и гистамин; аденин и гуанин состоят из двух конденсированных колец пиримидина и имидазола; имидазольное кольцо входит в состав витамина В12 [8]. Выявленные в мускулатуре позвоночных животных эрготонин и карнозин и другие соединения имидазола участвуют в восстанавлении активности многих ферментов [9].

Возможно, поэтому многие синтетические биологически активные соединения являются имидазолидами [1, 6, 7].

Целью данного исследования явился анализ генотоксичности некоторых производных имидазола и поиск корреляций между их биологической активностью и физико-химическими параметрами, а так же выяснения роли физико-химических параметров в развитии адаптивного ответа. Это позволит в дальнейшем синтезировать высокоэффективные пестициды с избирательной токсичностью.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В табл. 1 приведены физико-химические параметры и названия исследуемых имидазолидов и их краткое обозначение.

Для анализа генотоксичности имидазолидов использовали водные растворы в двух дозах: нетоксичной - это концентрация не вызывающая гемолиз эритроцитов человека (0,001 мг/мл) и LD50 (концентрации представлены в табл.2).

Генотоксичность оценивали по способности индуцировать доминантные летальные мутации. Учет доминантных летальных мутаций у имаго Drosophila. melanogaster проводили по методу Белоконь (1984).

Объектом исследования служили имаго дикой линии Canton-S.

Девственные самки и самцы содержались на стандартном корме, состоящем из 60 г дрожжей, 60 г бананов, 20 г изюма, 60 г манной крупы, 60 г сахара, 8 г агар-агара, 3 мл уксусной кислоты на 1 л воды.

Было проведено несколько серий эксперимента.

• 1    Серия. Анализ способности имидазолидов индуцировать доминантные летальные мутации.

Для анализа способности соединения индуцировать доминантные летали, соединения использовали в двух концентрациях - 0,001мг/мл и доза LD50, растворителем служила кипяченая вода.

Для анализа мутагенности соединения для самцов, их в течение 24 часов содержали в популяционных ящиках, куда были внесены чашки Петри с исследуемым соединением. Затем 900 самцов скрещивали с 600 интактными девственными самками.

Для анализа способности соединения индуцировать доминантные летали у самок их подвергали тем же воздействиям, что и самцов, затем 900 девственных, обработанных исследуемым имидазолидом, са- мок скрещивали с девственными интактными самцами (600 самцов).

После скрещивания, в течение 12 часов через каждые 2 часа в популяционные ящики, где происходило скрещивание, вносили чашки Петри с кормом для сбора кладки яиц.

Таблица 1. Физико-химические параметры исследуемых соединений

Название соединения	Молекулярная масса (г/моль)	Молекулярный объем (Å3)	Энергия гидратации (ккал/моль)	LogP	Суммарный дипольный момент (дебай)
Имидазол (Im)	68.08	274.26	-8.5	-0.97	3.599
N-метилимидазол (NmeIm)	82.11	330.93	-3.89	-0.73	3.927
2-метилимидазол (CmeIm)	82.11	330.01	-6.4	-0.94	3.699
N-имидазолид-метансульфокислоты (ImSO 2 CH 3 )	146.16	419.83	-6.55	-1.53	3.53
N-имидазолид-бензолсульфокислоты (ImSO 2 Phe)	208.23	575.41	-7.49	-1.04	5.1
N-имидазолид-тозилсульфокислоты (ImSO 2 Tol)	222.26	629.06	-6.28	-0.88	5.62

Таблица 2. Концентрация водных растворов (в мг/мл) имидазолидов вызывающих в течение суток 50% гибель имаго Drosophila. melanogaster
Название соединения	Самки	Самцы
Im	5,0	3,2
NmeIm	6,1	7,2
CmeIm	50,0	47,0
ImSO 2 CH 3	27,0	16,0
ImSO 2 Phe	24,0	37,6
ImSO 2 Tol	10,4	16,7

После первичного подсчета яиц (под бинокулярной лупой МБС-9), чашки помещали в термостат при +22°С на 30 часов для развития яиц. После этого подсчет проводился вторично с учетом развившихся яиц. Подсчет ДЛМ ведется по формуле:

A-В

% ДЛМ =---- *100% ,

А

где А- общее количество яиц за сутки, В- количество личинок через сутки и плюс неоплодотворенные яйца.

• 2    Серия. Исследование способности имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго Drosophila melanogaster к последующему генотоксичному действию этими же соединениями в дозе LD 50. Преадаптация 1 типа (кратковременная).

Экспериментальные имаго самки и самцы раздельно по 900 штук содержались в популяционных ящиках, в которые помещались чашки Петри с нанесёнными растворами имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл. Через сутки чашки удалялись, и на их место помещались новые с растворами исследуемых соединений в дозе LD50, и воздействие продолжалось ещё сутки. Затем, чашки из популяционных ящиков удалялись, а имаго скрещивались с интактными особями противоположного пола, и производился анализ индуцированных доминантных леталей как описано в 1 серии.

• 3    Серия. Исследование способности имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок Drosophila melanogaster к последующему генотоксичному действию исследуемых имидазолидами в дозе LD _50. Преадаптация 2 типа (долговременная)

Личинок Drosophila. melanogaster, синхронизированных по вылуплению из яйца, рассаживали в сахарные стаканчики, в которых корм содержал имидазолиды в концентрации 0,001 мг/мл. Таким образом, личинки проводили весь личиночный период жизни и стадию куколки на этой среде. Далее отбирали девственных самцов и самок, на которых воздействовали исследуемыми имидазолидами в дозе LD 50 по схеме эксперимента для анализа прямого мутагенного действия.

• 4    Серия. Исследование способности имидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго Drosophila melanogaster к последующему генотоксичному действию исследуемых имидазолидами в дозе LD ₅₀. Преадаптация 3 (кратковременная).

Экспериментальные имаго самки и самцы раздельно по 900 штук содержались в популяционных ящиках, в которые помещались чашки Петри с нанесёнными растворами имидазола в концентрации 0,001 мг/мл. Через сутки чашки удалялись, и на их место помещались новые с растворами исследуемых соединений в дозе LD50, и воздействие продолжалось ещё сутки. Затем, чашки из популяционных ящиков удалялись, а имаго скрещивались с интактными особями противоположного пола, и анализировали число доминантных леталей, как это делалось в серии 1.

• 5    Серия. Исследование способности имидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок Drosophila melanogaster к последующему генотоксичному действию исследуемыми имидазолидами в дозе LD ₅₀ Преадаптация 4 типа (долговременная).

Личинок Drosophila. melanogaster, синхронизированных по вылуплению из яйца, рассаживали в сахарные стаканчики, в которых корм содержал имидазол в концентрации 0,001 мг/мл. Таким образом, личинки проводили весь личиночный период жизни и стадию куколки на этой среде. Далее отбирали виргильных самцов и самок, на которых воздействовали исследуемыми имидазолидами в дозе LD₅₀ по схеме эксперимента для анализа прямого мутагенного действия и оценивали число доминантных леталей.

Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Оценка связи между генотоксично- стью соединений и физико-химическими параметрами исследуемых имидазолидов проводилась с помощью корреляционного анализа (Лакин, 1990)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 3 представлены результаты прямого действия исследуемых соединений на имаго дрозофилы. Как видно из представленных экспериментов все анализируемые производные имидазола и сам имидазол и в нетоксичной дозе, и в дозе LD50 индуцируют доминантные летальные мутации как у самок, так и самцов Drosophila melanogaster.

Таблица 3. Способность имидазолидов индуцировать доминантные летальные мутации у имаго Drosophila melanogaster

Название соединений	Доминантные летали в % индуцированные у
	самок		самцов
	0,001мг/мл	LD 50	0,001мг/мл	LD 50
Im	18,3±0,2	21,8±0,2	16,0±0,1	19,6±0,1
NmeIm	16,8±0,2	18,3±0,2	12,8±0,3	13,4±0,3
CmeIm	18,8±0,1	21,1±0,1	15,8±0,1	20,2±0,1
ImSO 2 CH 3	26,9±0,3	24,1±0,3	16,0±0,4	19,8±0,4
ImSO 2 Phe	6,0±0,1	8,36±0,1	5,1±0,3	7,4±0,3
ImSO 2 Tol	9,0±0,2	10,46±0,2	5,8±0,2	6,74±0,2

Таблица 4. Величины коэффициентов корреляций между исследуемыми параметрами

Физико-химические параметры	Индуцированные доминантные летали в % у самок		Индуцированные доминантные летали в % у самцов
	0,001мг/мл	LD 50	0,001мг/мл	LD 50
Молекулярная масса	-0,61	-0,79	-0,86*	-0,86*
Молекулярный объем	-0,68*	-0,84*	-0,90*	-0,85*
Суммарный дипольный момент	-0,88*	-0,95*	-0,97*	-0,92*

Примечание: звездочкой отмечены коэффициенты корреляции значимые для p<0,05.

Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что все соединения достоверно для p<0,05 различаются по мутагенности, и в нетоксичной дозе и полулетальной дозе соединения достоверно больше индуцируют мутации у самок, чем у самцов. Кроме того анализ показал, что в полулеталь-ной дозе имидазол и его производные достоверно больше индуцируют доминантных леталей, чем в нетоксичной дозе (p<0,05). Мутагенная активность убывает в следующем ряду:

ImSO 2 CH 3 ≥ Im = CmeIm > NmeIm > ImSO 2 Tol> ImSO 2 Phe

Мы провели корреляционный анализ между физико-химическими свойствами исследуемых веществ и их мутагенность. Результаты корреляционного анализа суммированы в таблице 4.

Проведенные исследования показали, не зависимо от дозы способность индуцировать доминантные летали у имаго дрозофилы высоко отрицательно коррелировала с величинами молекулярного объема и суммарного дипольного момента, и не коррелировала с лиофильностью и величиной энергии гидратации. По нашему мнению это является показателем того, что данные соединения попадают в клетки мишени, используя специальные рецепторы, а не с помощью диффузии через мембраны, что согласуется с данными ряда автором о наличии у многих клеток имидазолиновых рецепторов [10, 11].

Важность данных физико-химических параметров для развития мутагенного ответа были получены и для других классов органических веществ [1, 4].

Анализируя возможность развития адаптивного ответа к мутагенному действию исследуемых соединений, мы провели две серии экспериментов. В одной серии (см. Материалы и методы Серия 2. Преадаптация 1 ) создавалась кратковременным (в течение суток) воздействием на имаго соединениями в нетоксичной дозе и с последующим воздействием этими же веществами в дозе LD50. В другой серии эксперимента ( Серия 3. Долговременная преадаптация 2 ) исследуемые имидазолиды воздействовали на дрозофилу в течение всего личиночного периода жизни, и имаго, подвергнутых такому воздействию подвергались суточному воздействию этими же соединениями в дозе LD50. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 5.

При кратковременной преадаптации с последующим воздействием на имаго дозой LD 50 (Преадаптация 1 типа) число индуцированных доминантных леталей у самок и самцов достоверно не отличается, однако, как показал проведенный двухфакторный дисперсионный анализ, соединения после преадаптации сохранили достоверные различия в способности индуцировать доминантные летальные мутации (p<0,05). Сравнение числа индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадаптации с числом доминантных леталей индуцированных прямым воздействием дозой LD50 показало, что эти величины достоверно не отличаются для p<0,05.

Таблица 5. Число индуцированных имидазолидами в дозе LD 50 доминантных летальных мутаций, после преадаптаций различного типа дрозофилы нетоксичной дозой этих соединений

Исследуемое соединение	Преадаптация 1 типа, кратковременная преадаптация 0,001 мг/мл + LD 50		Преадаптация 2 типа, долговременная преадаптация 0,001 мг/мл + LD 50
	самки	самцы	самки	самцы
Im	19,4±0,09	16,0±0,03	13,9±0,1	11,0±0,04
NmeIm	13,5±0,1	9,9±0,02	7,5±0,1	6,3±0,1
CmeIm	17,1±0,2	16,1±0,1	9,2±0,2	7,1±0,1
ImSO 2 CH 3	14,8±0,1	20,0±0,06	11,1±0,05	10,1±0,1
ImSO 2 Phe	7,1±0,08	6,0±0,04	7,2±0,1	6,1±0,03
ImSO 2 Tol	11,43±0,11	9,13±0,1	6,9±0,06	6,1±0,04

Долговременная преадаптация (преадаптация 2 типа) нетоксичной дозой в течение всего личиночного периода жизни, выявило адаптивный ответ, то есть число индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадаптации достоверно (p<0,01) меньше, чем при прямом воздействии полулетальной дозой. Кроме того, число индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадаптации достоверно различалось (p<0,01).

Мы проанализировали, какие из физикохимических параметров являются определяющими в развитии адаптивного ответа. Для этого мы высчитали разницу между числом доминантных леталей при прямом действии и числом доминантных леталей после долговременной преадаптции имидазолидами к самим себе. Затем провели корреляционный анализ между полученной разницей и исследованными физико-химическими параметрами. Обнаружили высокую (достоверно для p<0,05) отрицательную корреляцию с величинами молекулярной массы (r♀ = -0,72, r♂ = -0,83), молекулярного объема(r♀ = -0,77, r♂ = -0,85), суммарного дипольного момента (r♀ = -0,87, r♂ = -0,92). Можно предположить, чем эффективнее соединение взаимодействует с рецепторами на поверхности клеток, тем быстрее развивается адаптивный ответ. В пользу этого говорит, отрицательная корреляция между проанализированными физико-химическими параметрами соединений и адаптивным ответом к ним.

Для того чтобы доказать это предположение и выяснить роль функциональных групп исследуемых имидазолидов в развитии адаптивного ответа, мы провели еще две серии экспериментов, в которых кратковременная и долговременная преадаптации осуществлялись нетоксичной (0,001 мг/мл) дозой имидазола к последующему воздействию имидазолидами в дозе LD50. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 6.

Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что ни кратковременное, ни долговременное предварительное воздействие имидазолом не создает преадаптацию к мутагенному действию имидазолидами, у имаго дрозофилы. Предварительное воздействие нетоксичной дозой имидазола, не только не ослабляли мутагенное действие производных имидазола в дозе LD50, но усиливали его, что говорит по нашему мнению о том, что у Drosophila melanogaster существуют несколько отличные механизмы адаптаций к мутагенному действию имидазола и его производных. Усиление мутагенного ответа особенно ярко выражено для имидазолидов, содержащих бензольное кольцо - ImSO₂Phe и ImSO₂Tol, которые при прямом действии демонстрировали самую слабую мутагенность. Это свидетельствует, по нашему мнению о независимом действии этих имидазолидов и имидазола, поэтому наблюдается суммированное действие исследуемых веществ, кроме того, это говорит о возможном существования различных типов имидазолиновых рецепторов.

Подводя итоги проделанным экспериментам можно сказать, что для имидазола и исследованных нами его производных определяющим в развитии мутагенного ответа являются такие параметры как молекулярная масса, молекулярный объем и суммарный дипольный момент, что свидетельствует в пользу предположения, что на поверхности клеток-мишений существуют специфические рецепторы для имидазолидов, и что их несколько типов. Репаративные механизмы к специфическому действию конкретного вещества активируются и запускаются в момент взаимодействия ксенобиотика и мембранного рецептора. По-видимому, косвенным доказательством этого является обнаруженная корреляция между теми же физико-химическими параметрами и адаптивным ответом к генотоксическому действию исследуемых соединений.

Таблица 6. Число индуцированных имидазолидами в дозе LD₅₀ доминантных летальных мутаций, после преадаптаций различного типа дрозофилы нетоксичной дозой имидазола

Исследуемое соединение	Преадаптация 3 типа, кратковременная преадаптация Im 0,001 мг/мл + имидазолиды LD 50		Преадаптация 4 типа, долговременная преадаптация Im 0,001 мг/мл + имидазолиды LD 50
	самки	самцы	самки	самцы
Im	19,4±0,1	16,0±0,3	13,9±0,1	11,0±0,04
NmeIm	14,8±0,2	13,8±0,1	14,99±0,2	8,99±0,2
CmeIm	16,6±0,1	15,7±0,3	16,2±0,1	13,4±0,5

ImSO 2 CH 3	20,2±0,2	18,7±0,6	17,76±0,8	14,5±0,6
ImSO 2 Phe	21,1±0,1	19,5±0,1	19,5±0,1	18,8±0,1
ImSO 2 Tol	23,6±0,2	20,0±0,4	28,4±0,2	10,8±0,1

Кроме того огромную роль в развитии адаптивного ответа играет время воздействия нетоксичной дозой перед последующим воздействием дозой LD50. Кратковременная преадаптация веществ самих к себе не способна индуцировать репаративные системы, долговременная преадаптация напротив развивает адаптивный ответ, выражающийся в том, что число доминантных леталей снижается.