Физико-химические свойства экзополисахарида Lactococcus lactis

Среди микробных биополимеров особое место занимают экзополисахариды (ЭПС). Источником получения экзополисахаридов на сегодняшний день являются многие бактерии, в том числе молочнокислые [1-5]. Известно, что они обладают реологическими, иммунности-мулирующими, ранозаживляющими, пленкообразующими свойствами [3-5]. Однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных об их структуре, физико-химических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.

В связи с этим, целью работы явилось изучение физико-химических свойств экзополисаха-рида Lactococcus lactis В-1662.

Молекулярную массу экзополисахари-да определяли методом аналитической гель-хроматографии [7], используя гелевый носитель TSKgel G 6000 PWXL (Япония). ЭПС идентифицировали на автоматическом анализаторе 2690 Allianse Waters. Наличие фракций ЭПС L.

Фокина Надежда Александровна, микробиолог.

lactis В-1662 определяли методом ионообменной хроматографии, используя носитель DEAE-Toyopearl 650 M [8].

Моносахаридный состав определяли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с целлюлозным носителем [9].

Относительную вязкость определяли с помощью стеклянного вискозиметра ВПЖ-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе изучали физико-химические свойства ЭПС L. lactis B-1662, который был получен нами ранее из культуры L. lactis B-1662 [10]. Данный ЭПС представлял собой порошок светло-коричневого цвета, без запаха, не имеющий в своем составе белка. Для его получения культуру L. lactis B-1662 выращивали на среде A. Welman [11] с сахарозой при температуре 27 ºС, рН 5,5 в течение 48 ч на шуттель-аппарате при 180 об/мин. Очистку ЭПС проводили методом гель-фильтрации на колонке c носителем Sephadex G-10.

Молекулярную массу экзополисахарида определяли методом аналитической гель -хроматографии на колонке TSKgel G6000 PWXL. Колонку калибровали стандартными образцами сахаров с известными молекулярными массами, такими как: глюкоза 6 тыс Да, Dextran 10 тыс Да, Dextran 110 тыс Да, Dextran 2 млн Да («Fluca», Швейцария, «Merck» Германия). Экзополисаха-рид L. lactis B-1662 детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters (рис. 1). Как видно из табл. 1, молекулярная масса L. lactis B-1662 была равна 10000 Да (табл. 1).

Дальнейшую очистку ЭПС L. lactis В-1662 проводили, используя метод ионообменной хроматографии на колонке с анионообменни-ком DEAE- Toyopearl 650М (20х200 мм). Элюцию проводили в два этапа: первоначально буфером 0,04 % NaN₃, 0,05М КH₂PO₄. После отделения нейтральных фракций, элюцию осуществляли раствором NaCl в том же буфере с градиентом концентрации 1М. Фракции с колонки собирали

Таблица 1. Определение молекулярной массы ЭПС L. lactis В-1662 на колонке TSKgel тип G6000 PWXL

Рис. 1. Хроматограмма определения молекулярной массы ЭПС, полученного из L lactis В-1662 на сахарозе на колонке с TSKgel G6000 PWXL с помощью коллектора и затем исследовали на содержание углеводов фенол-серным методом [12]. Как видно из хроматограммы на рис. 2, образцы выходили одной фракцией соответствующей нейтральным веществам. Наличие одной нейтральной фракции было характерно и для некоторых ЭПС таких молочнокислых бактерий как Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus [13]. Хотя в литературе имеются данные о гетерогенности ЭПС некоторых штаммов лактококка [14].

Используя метод тонкослойной хроматографии, которую проводили на пластинке с целлюлозным носителем POLIGRAM® GEL 300 с толщиной слоя 0,1мм, определяли моносахаридный состав ЭПС L. lactis B-1662. В качестве «свидетелей» использовали спиртовые растворы моносахаров (Fluca) таких как: D- глюкоза, D -галактоза, L - манноза, D - рамноза, D- глюкоуроновая кислота, D - ксилоза. Гидролиз ЭПС проводили 2 н. раствором трифторуксусной кислоты при 110° С в течение 3 часов. Элюентом являлся раствор, состоящий из этилацетата, пиридина, уксусной кислоты, воды в соотношении 5:5:1:3. В качестве проявителя использовали анилин фталат. Было определено, что в состав ЭПС входят ксилоза и глюкоза (рис. 3). Полученные результаты согласуется с литературными данными о том, что глюкоза и ксилоза, наряду с маннозой, рамнозой, галактозой могут являться структурными моносахаридами ЭПС [15,16].

В процессе исследований было установлено, что ЭПС изучаемой культуры обладал низкой вязкостью и это не позволяло определить динамическую вязкость. Относительная вязкость была определена с помощью капиллярного вискозиметра и составила 1,3 мм2/с. Значение относительной вязкости было сопоставимо с показателем вязкости ЭПС других молочнокислых бактерий – лактобацилл [14].

Рис. 2. Ионообменная хроматография ЭПС L. lactis В-1662 на DЕAE - Toyopearl 650M

Рис. 3. Определение моносахаридного состава ЭПС L. lactis В-1662 методом тонкослойной хроматографии

Примечание: 1,2,4 – углеводы-свидетели, 3-ЭПС

Таким образом, из культуральной жидкости L. lactis B-1662 впервые выделен ЭПС, представленный одной нейтральной фракцией с молекулярной массой 10000 Да, обладающей небольшой относительной вязкостью.