Физиологические и патофизиологические предпосылки репаративного потенциала эпикарда

Перикард является наружной оболочкой сердца, наружный слой которого образован соединительной тканью и прикрепляется к диафрагме, плевре и грудине, а внутренний — разделяется на два листка: висцеральный и париетальный [1]. В процессе эмбриогенеза эпикард продуцирует мультипотентные клетки-предшественники — про-гениторные клетки эпикарда (ПКЭ), которые затем подвергаются эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) [2]. ПКЭ дают начало различным типам клеток — фибробластам, адипоцитам, кардиомиоцитам, эндотелиальным клеткам и гладкомышечным клеткам сосудистой стенки [3].

Эпикард синтезирует также ряд паракринных факторов, которые обеспечивают рост коронарных сосудов, а также дифференцировку и развитие миокарда [4, 5]. Когда формирование сердца завершено, происходит подавление экспрессии этих факторов, остановка пролиферации и образование сплошного слоя клеток с плоскоклеточной морфологией — собственно клеток эпикарда [6, 7]. Перераспределение клеток проэпикарда и полное покрытие сердца человека происходит к концу пятой недели эмбриогенеза (табл. 1) [8, 9].

Для того, чтобы понять основные принципы современных экспериментальных методов активации эпикарда и, как следствие, его репаративного потенциала, необходимо обратиться к некоторым генетическим, биохимическим и молекулярным взаимодействиям, лежащим в основе этого процесса.

ФОРМИРОВАНИЕ ЭПИКАРДА В ПРОЦЕССЕЭМБРИОГЕНЕЗА

Во время эмбриогенеза эпикард формируется из проэпикардиальных клеток, происходящих от перикардиального целомического мезотелия [21]. У млекопитающих перемещение проэпикар-диальных клеток происходит путём образования свободно плавающих клеточных агрегатов и прямого контакта с поверхностью миокарда [22, 23]. У большинства видов эпикард представлен одним слоем клеток, однако у человека это многослойные мезотелиальные клеточные образования [24]. Между эпикардом и миокардом находится субэпи- кардиальное пространство, в котором располагаются эластические волокна, кровеносные сосуды, а также жировая ткань, которая может там аккумулироваться в течение жизни [25, 26]. Как только созревание эпикарда завершено и он полностью окружил миокард, эпикардиальные клетки начинают экспрессировать различные транскрипционные факторы.

Одним из первых начинает свою работу транскрипционный фактор-21 Tcf21 (transcription factor-21). Этому фактору придают важную роль в развитии эпикарда. Было показано, что отсутствие Tcf21 сохраняет свойства ПКЭ и не позволяет формировать упорядоченные клеточные пласты [27] . К другим значимым факторам транскрипции относят следующие: фактор опухоли Вилмса-1, WT1 (Wilms’ tumor factor-1), участвующий в эпикардиальной адгезии и сохранении компактности ткани за счёт активации другого транскрипционного фактора — Т-box18 (T-box transcription factor-18) [28] . Последний, в свою очередь, поддерживает статус ПКЭ, формируя их регенераторный потенциал [29, 30]. В исследованиях на мышах было описано, что благодаря этим и некоторым другим факторам инициируется и поддерживается ЭМТ. В то время как WT1 определяет эпикардиальные свойства ткани и ингибирует ЭМТ путём подавления экспрессии Slug [Slug (SNAI2) наряду с SNAI1 являются главными регуляторными факторами транскрипции для органогенеза и заживления ран], T-bоx18 обладает обратным действием. В условиях повышения экспрессии Slug и инициации ЭМТ происходит пролиферация клеток, а также дифференцировка и созревание эпикарда [31]. Как уже было отмечено, эпикард является не только источником клеток и эпикардиального матрикса, но и синтезирует различные паракринные факторы, критически значимые для правильного формирования миокарда и коронарных артерий [32].

МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ СЕРДЦАВ НОРМЕ

В процессе развития эмбрионального сердца некоторая часть ПКЭ проходит ЭМТ. Это сложный процесс, в ходе которого клетки подвергаются транскрипционному перепрограммированию —

Таблица 1 / Table 1

Некоторые паракринные факторы, выделяемые эпикардом, и их роль в морфогенезе сердца / Some paracrine factors secreted by the epicardium and their role in heart morphogenesis

Паракринный фактор / Paracrine Factor Роль / Role Факторы транскрипции GATA4 и GATA6 [10] / Transcription factors GATA4 and GATA6 [10] Правильное формирование коронарных артерий за счёт регуляции субэпикардиальных эндотелиоцитов / Proper formation of the coronary arteries through the regulation of subepicardial endothelial cells Ретиноевая кислота (витамин А) и её рецепторы [11, 12] / Retinoic acid (vitamin A) and its receptors [11, 12] Стимуляция пролиферации кардиомиоцитов (с участием FGF-9 и FGF-2) и обеспечение прилежания миокарда к эпикарду / Stimulation of cardiomyocyte proliferation (involving FGF-9 and FGF-2) and ensuring the adhesion of the myocardium to the epicardium Различные факторы роста фибробластов (FGF) и их рецепторы [13, 14] / Various fibroblast growth factors (FGF) and their receptors [13, 14] Стимуляция пролиферации кардиомиоцитов, инвазии эпикардиальных клеток в миокард (путём активации FGFR1) и обеспечение правильного формирования миокарда / Stimulation of cardiomyocyte proliferation, invasion of epicardial cells into the myocardium (via FGFR1 activation), and ensuring proper myocardium formation Сигнальный белок Hedgehog [15, 16] / Hedgehog signaling protein [15, 16] Созревание миокарда и коронарных артерий / Maturation of the myocardium and coronary arteries Хемокины подсемейства CXC (стромальный клеточный фактор-1) [17, 18] / CXC subfamily chemokines (stromal cell factor-1) [17, 18] Развитие коронарных артерий (за счёт продукции CXCL12) / Development of the coronary arteries (through the production of CXCL12) Трансформирующие факторы роста (TGF) [19] / Transforming growth factors (TGF) [19] Потеря эпикардиального фенотипа и дифференцировка по типу гладкомышечной ткани (TGFβ1и TGFβ2) / Loss of the epicardial phenotype and differentiation into smooth muscle-like cells (TGFβ1 and TGFβ2) Сигнальный путь Wingless-WNT/β-catenin [20] / Wingless-WNT/ β-catenin signaling pathway [20] Дифференцировка клеток с самых ранних этапов развития сердца, формирование клапанов, активация эпикарда / Differentiation of cells from the earliest stages of heart development, valve formation, and activation of the epicardium утрате эпителиальных свойств, и дифференцировке в подвижные мезенхимальные клетки [33]. Известно, что эпителиальные клетки имеют ряд отличительных черт: апикально-базальную полярность, неподвижность и межклеточные щелевые контакты. ЭМТ приводит к разрушению межклеточных взаимодействий, потере полярности и реорганизации цитоскелета путём подавления эпителиальных генов с последующей активацией мезенхимальных. Экспрессия медиаторов, участвующих в ЭМТ, и их связь с соответствующими рецепторами инициирует внутриклеточный молекулярный каскад, который способствует смене фенотипа клеток [34, 35].

До сих пор остаётся неясным, все ли эпикардиальные клетки могут быть подвержены ЭМТ, или только некоторые из них способны к такому переходу [3]. Исследования показали, что β -катенин, один из белков семейства катенинов, которые участвуют в формировании межклеточных контактов и определяют эпителиальный фенотип клеток, влияет на работу генов, участвующих в ЭМТ [36,

• 37] . Подавление экспрессии β -катенина приводит к пространственному нарушению формирования веретёна деления в ПКЭ и утрате ими промигра-ционного потенциала [37].

ЭМТ регулируется рядом транскрипционных факторов (SNAI1, SNAI2, HAND2, TWIST1). В результате этой трансформации образуются клетки с мезенхимальным фенотипом — ПКЭ, которые способны к пролиферации и активной миграции. В этом процессе принимают участие и некоторые биомолекулы. Например, локальная экспрессия трансформирующего фактора роста β (TGF- β ) и оснóвного фактора роста фибробластов (b-FGF) способствует деградации базальной мембраны, реорганизации цитоскелета и перегруппировке актина, что необходимо для процесса перемещения клеток [34]. TGF- β также стимулирует экспрессию транскрипционных факторов SNAI1 и SLUG, которые подавляют транскрипцию эпителиальных генов, способствуя ЭМТ и подвижности клеток [36].

Другим важным фактором, делающим ЭМТ возможной, является тимозин- β -4 (Т β 4) — белок, связывающий мономер актина и регулирующий подвижность клеток [38]. Приобретая мезенхимальный фенотип, клетка мигрирует в противоположном от базальной мембраны направлении. Через субэпикардиальное пространство ПКЭ внедряются в толщу миокарда, где подвергаются дифференцировке in situ в различные типы клеток в зависимости от действующих на них конкретных биомолекул [3]. Известно, что превращение ПКЭ в одну из наиболее представленных клеточных групп в сердце — фибробластов (именно эти клетки продуцируют экстрацеллюлярный матрикс) — происходит под влиянием комплекса медиаторов: HAND2 (через рецептор тромбоцитарного фактора роста α , PDGFR α ), ретиноевой кислоты, транскрипционного фактора Tcf21 [39, 40]. Образование гладкомышечных клеток, которые являются компонентами сосудистой стенки новых коронарных сосудов, активируется факторами: Notch, TGF- β 1 и β 2, Tcf21 и HAND2 (через рецептор тромбоцитарного фактора роста β ) [41–44].

В отношении происхождения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов ведутся дискуссии. В нескольких независимых исследованиях было показано, что эндотелиальные клетки коронарных сосудов имеют неэпикардиальное происхождение. Вероятно, у млекопитающих они происходят из венозного синуса и эндокарда желудочков [29, 45, 46]. Однако в более поздних исследованиях с применением Cre-Lox рекомбинации (метода, позволяющего отследить клеточное происхождение и дальнейшее развитие) продемонстрировано, что некоторая субпопуляция эндотелиальных клеток в коронарной сосудистой сети берёт начало из поперечной перегородки (septum transversum), то есть из мезотелиальных клеток проэпикарда [47]. Предполагают, что медиатором в формировании и созревании коронарных артерий выступает цитокин CXCL12 (фактор стромальных клеток-1, Stromal Cell-derived Factor, SDF-1) [17, 18].

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ЭПИКАРДА В ОТВЕТ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

В постнатальном периоде эпикард стабилизируется и в норме не проявляет пролиферативных и промиграционных свойств. Однако в ответ на повреждение эпикардиальные клетки реактивируются по типу эмбриональных, включая экспрессию генов Wt1 и генетических маркеров ЭМТ — T-box18 и SNAI1. Так клетки подвергаются ЭМТ и мигрируют в субэпикардиальное пространство для участия в репарации ткани — эти два процесса крайне важны для обеспечения регенерации миокарда [51, 52]. У мышей первой недели жизни обнаружена возможность полного восстановления сердца после повреждения [53]. Получены данные, что у новорождённых мышей после резекции верхушки сердца в области повреждения образуются гладкомышечные клетки и кардиомиоциты с генетической меткой T-box18+, характерной для эпикардиальных клеток. Однако дальнейшие исследования показали, что подобные метки имеются и в компонентах уже существовавших коронарных артерий. Проанализировав полученные данные, исследователи пришли к выводу, что даже зрелое сердце способно к восстановлению миокарда после повреждения, но этот потенциал крайне мал и прогрессивно снижается после рождения [54].

Отмечено, что в эпикарде сформированного сердца, перенёсшего ишемические события, про- исходит активация ранних генов развития (Wt1, T-bоx18, Raldh1, SNAI1, αSMA) [49, 55, 56]. Пик активности данных генов приходится на 3–5 сутки после воспроизведённого инфаркта миокарда и сохраняется до 7 дней [57], а по некоторым данным вплоть до 14 дней, охватывая до 75% эпикардиальных клеток, а затем постепенно снижается [48, 49]. Интересно, что активация происходит не только в области поражения, но и по всей поверхности эпикарда, что, по-видимому, осуществляется за счёт перикардиальной жидкости [55, 58]. Молекулярные механизмы этих изменений остаются неясными, однако некоторые авторы полагают, что именно гипоксия и фактор, индуцированный гипоксией-1α, HIF-1α, являются триггерами реактивации эпикарда в ответ на повреждение [59, 60].

При моделировании на мышах получены данные о дифференцировке ПКЭ в миокардиальные фибробласты. Популяция этих клеток активно синтезирует коллаген для замещения повреждённых кардиомиоцитов с образованием рубцовой ткани [61–63]. Кроме того, установлено, что клетки эпикарда мышей могут превращаться в гладкомышечные клетки и перициты, и в меньшей степени в эн-дотелиоциты. Все перечисленные клетки являются компонентами сосудистой стенки [29, 64]. В 2015 г. группой учёных из Калифорнийского Центра изучения регенеративной медицины и исследований стволовых клеток (Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research) с помощью метода отслеживания клеточного происхождения было выяснено, что эпикард может давать начало и адипоцитам сердца [66].

Тем не менее вокруг регенеративного потенциала эпикардиальных клеток ведутся споры. В ряде исследований обнаружено, что образование новых клеток в ответ на повреждение происходит из уже существующих в ткани сердца [54, 67–69], в то же время данных об увеличении популяции кардиомиоцитов и вовсе получено не было [70]. Даже несмотря на то, что было зафиксировано накопление КПЭ в области резецированной верхушки сердца у полосатой рыбки Danio rerio, часть из которых трансформировалась в кардиомиоциты, чётких доказательств в пользу их именно эпикардиального происхождения не получено [71]. В последую- щих работах, выполненных на трансгенных мышах, было установлено, что кардиомиоциты могут происходить из клеток эпикарда. Однако полученные результаты ставятся под сомнение, поскольку метки T-bоx18 и Wt1, использованные для отслеживания клеточного происхождения в ходе этого эксперимента, могут самостоятельно присутствовать у кардиомиоцитов [29, 64, 72].

В 2017 г. была обнаружена экспрессия CD73 на поверхности ПКЭ в области инфаркта миокарда. Этот белок способен превращать внеклеточный АТФ и НАД в аденозин. Внеклеточный аденозин стимулирует выработку интерлейкина-6 и интерлейкина-11, а также фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Кроме того, получены данные о способности ПКЭ к продукции профибротиче-ского белка тенасцина-C, способствующего миграции данных клеток. Таким образом, создавшееся микроокружение поддерживает ангиогенез и воспалительные процессы в области повреждения, что необходимо для восстановления сердца [73]. Более того, этот многоклеточный слой способствует иммунной регуляции, устраняет погибшие клетки и внеклеточные фрагменты из повреждённой области, содействуя возобновлению клеточной популяции в зоне повреждения и стимулируя регенеративные реакции и кардиопротективные свойства повреждённого сердца [74, 75].

В более позднем исследовании был описан протокол выращивания ПКЭ как эмбриональных, так и созревших, в ходе которого были успешно сохранены свойства эпителиальных клеток, а ЭМТ они подвергались только под влиянием TGF- β [52]. Воспроизведённые эмбриональные ПКЭ обладали меньшими способностями к миграции, но активнее проходили через ЭМТ и были более чувствительны к изменениям внешней среды, чем ПКЭ взрослого человека. Хотя точные механизмы этого явления остаются неясными, полученная клеточная культура обладает способностью к активации клеток и пластичностью, что предполагает возможное применение на эпикарде человека.

Схожие результаты получены другой группой учёных — использование BMP4 и ретиноевой кислоты способствовало дифференцировке пула человеческих эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных клеток в ПКЭ без использования WNT. При имплантации их в эмбрионы цыплят возникшие ПКЭ демонстрировали функциональные свойства в виде адгезии и распространения в ткань миокарда. При этом одни исследователи обнаруживали инъецированные клетки преимущественно в субэпикардиальном пространстве, в то же время другие указывали, что клетки, выращенные разработанным методом, распространялись через толщу миокарда и включались в эпикард, что предположительно объясняется более близкой принадлежностью к эпителиальным клеткам [76].

ТЕХНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ЭПИКАРДА

Важным аспектом в исследованиях активации эпикарда является способ доставки биологически активных веществ к месту назначения. На начальных этапах введение человеческих ПКЭ мышам проводилось непосредственно в область некроза миокарда, что способствовало поддержанию функции сердца со второй и вплоть до шестой недели после инфаркта. Тем не менее, имплантированные клетки экспрессировали α -актин гладкомышечных клеток и фактор фон Виллебранда, но не маркеры кардиомиоцитов. Также было отмечено, что ПКЭ незначительно интегрировались в сосудистую стенку и существовали относительно короткий период времени — лишь небольшое их количество определялось через 6 недель. Авторы полагают, что вклад ПКЭ в васкулогенез в основном опосредован паракринным механизмом [77]. Впоследствии этой же группой учёных проведена совместная трансплантация человеческих ПКЭ и предшественников кардиомиоцитов, что заметно улучшило функцию левого желудочка по сравнению с использованием лишь одного типа клеток, как описано выше [78]. Такой эффект, по-види-мому, вызван коммуникацией между совместно трансплантированными клетками, приведшей к дополнительной секреции паракринных факторов.

Для внутримиокардиальной доставки лигандов сигнального пути Notch, являющегося критическим компонентом формирования сердечно-сосудистой системы и морфогенеза, были разработаны гидрогелевые основы, в результате чего улучшалась функция сердца и ангиогенез в постинфарктной области [79]. В экспериментах с Тβ4 были использованы такие методы доставки как интраперитонеальная инъекция [80, 81] и локальное (интрамиокардиальное) применение в виде коллаген-хитозановых гидрогелевых патчей [82]. Несмотря на то, что результаты экспериментов были противоречивы, использование упомянутых способов доставки несколько повысило эффективность методов по сравнению с внутривенным введением, но всё равно недостаточно соответствовало поставленным целям, что послужило стимулом для разработки других методов. Направленная доставка микросфер Тβ4 под транспозонную плаз-мидную систему привела к значительному увеличению продукции Тβ4 в сердцах крыс в течение 3 месяцев после инфаркта миокарда [83]. При таком способе доставки увеличенное количество клеток предшественников, синтезирующих Wt1, начало экспрессировать тропонин Т в миокарде. Доставка в миокард Тβ4 с помощью микросфер также способствовала продолжительному ангиогенезу, подтверждённому за счёт увеличения количества гладкомышечного α-актина, VEGF, TIE2 и мРНК PECAM, а также увеличения плотности коронарных артерий и капилляров. Важно, что под действием Тβ4 увеличивалась долгосрочная пролиферация кардиомиоцитов (до 3 месяцев), что определяло самовозобновление клеток [84].

Для создания кардиальных биопатчей могут быть использованы не только отдельные вещества, но и различные типы клеток, в том числе с возможностью целенаправленной дифференцировки для осуществления репарации сердечной ткани. Так, в 2017 г. Zhao et al. [85] произвели стимуляцию ПКЭ факторами Wnt и Ra, что привело к направлению трансформации этих клеток по эпикардиальному пути.

За последние годы стало очевидным, что использование низкомолекулярных соединений также может быть эффективным. В недавних исследованиях изучалась возможность применения малых молекул для стимуляции эпикардиальной дифференцировки и ЭМТ после инфаркта миокарда у крыс. Было показано, что низкомолекулярный сигнальный модулятор Wnt содействует ЭМТ и улучшает функцию сердца у крыс, перенёсших инфаркт миокарда [86].

В исследованиях 2017 года путь Wnt подвергался воздействию низкомолекулярным ингибитором GSK-3-CHIR99021, что привело к его стимуляции и превращению плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, подобные эпикардиальным [85]. Для увеличения популяции эпикардиальных клеток [87] использовали 3 различных низкомолекулярных ингибитора (GSK-3-CHIR99021, CHIR98014 и BIO-acetoxime), что блокировало до 95% популяции Wnt+ эпикардиальных клеток, а также ингибиторы рецепторов TGF- β 1-A83–01, RepSox, SB505124. Было продемонстрировано, что выращенные эпикардиальные клетки могут быть посеяны на биопатчи из внеклеточного матрикса, полученного от кардиальных фибробластов. У мышей с индуцированным инфарктом миокарда аппликация таких патчей на поверхность сердца привела к ускорению ЭМТ и значительной дифференцировке клеток в подобные фибробластам и гладкомышечным клеткам в толще миокарда. Однако длительная эффективность воздействия таких патчей на функцию повреждённого миокарда остаётся ограниченной [88].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идея использования репаративного потенциала эпикарда в ответ на повреждение миокарда ишемического генеза в настоящее время активно развивается. С одной стороны, идёт дальнейшее изучение механизмов репарации в лабораторных условиях на культурах тканей и линиях лабораторных животных, с другой — появляются первые данные о клиническом опыте применения стимуляции эпикарда в реальных условиях специализированных стационаров. Пока перевес явно на стороне доклинических исследований — получены убедительные данные о возможности воздействия цитокинами и рядом других молекул с целью изменения типа реакции с фиброзирования на репарацию. В основе этих исследований — понимание роли эпикарда в развитии миокарда и структур сердца в процессе эмбриогенеза человека и животных. В настоящее время изучена роль таких паракринных факторов, как факторы транскрипции GATA4 и GATA6, ретиноевая кислотя, трансформирующие факторы роста и факторы роста фибробластов. Некоторые из них показывают высокую эффективность при их использовании для стимуляции репарации миокарда не только in vitro, но и in vivo. Успехи в этом направлении уже нашли первые случаи применения в клинической практике, что, вероятно, в ближайшем будущем откроет новые перспективы помощи пациентам с поражением сердца.

Финансирование: Авторы заявляют об отсутствии финансирования.