Физиологические изменения микрореологических свойств эритроцитов в модели создания дислипидемии у крыс на поздних этапах онтогенеза

Введение. До сих пор в медицине и биологии сохраняется насущная потребность в продолжении изучения возрастных аспектов функционального состояния организма млекопитающих и человека. Было установлено, что реализация их имеет в своей основе генетическую [1, 2] и средовую составляющие, которые позволяют процессу старения затронуть все системы организма [3], прогрессив- но ухудшая их функционирование и делая его гибель все более вероятной [4]. Большое внимание при этом уделяется различным аспектам реологических особенностей крови и ее форменных элементов, в т.ч. связанным с возрастом [5, 6], в норме и в условиях различной патологии [7, 8], а также на фоне многих вариантов коррекционных воздействий на организм [9, 10].

Будучи одним из важнейших элементов микроциркуляции, эритроциты в значительной мере определяют гемодинамический и метаболический гомеостаз тканей [11] и влияют на реализацию многих адаптивных реакций организма [12, 13]. Замечено, что реологические свойства эритроцитов могут меняться при физиологических, пограничных и патологических состояниях [14, 15]. Достаточно уязвимы в этом плане зрелые и начинающие стареть организмы: при возникновении патологии у них развиваются изменения реологических свойств форменных элементов крови, что весьма отрицательно сказывается на микроциркуляции в целом и усугубляет общее состояние [3, 16].

При этом при получении новой научной информации о различных патологических состояниях у человека [4] невозможно обойтись без применения экспериментальных моделей, воспроизводящихся в т.ч. на крысах [17]. Ввиду важности роли эритроцитарных мик-рореологических свойств в развитии нарушений в организме [18], в т.ч. тромбофилии, связанной с возрастом, и необходимости разработки подходов по ее устранению у современных исследователей сохраняется высокий интерес к изучению агрегации и цитоархитектоники красных кровяных телец у стареющих крыс. Полученные сведения способны послужить основой для последующего экспериментального поиска подходов к оптимизации микрореологических свойств эритроцитов в поздних возрастах с последующим осторожным переносом данных в геронтологические исследования на человеке [19].

Современные физиология и медицина уделяют большое внимание изучению ранних этапов развития различной патологии и начальных механизмов ее реализации [20]. Весьма большой интерес проявляется исследователями к функциональным и реологическим особенностям форменных элементов крови [21, 22]. Установлено, что они играют большую роль в функционировании системы гемостаза при патологии, в т.ч. при весьма распространенных в настоящее время сердечно-сосудистых нарушениях и ведущих к ним обменных заболеваниях [8, 9]. Среди них во всем цивилизованном мире одну из лиди- рующих позиций занимает атеросклероз, приводящий к широкой инвалидизации населения и вносящий существенный вклад в цифры смертности у лиц трудоспособного возраста [2, 4]. Было замечено, что при развернутой клинической картине обменных нарушений, ведущих к прогрессированию атеросклероза, отмечается ухудшение микро-реологических свойств эритроцитов [14, 18] и ослабление дезагрегационных свойств сосудов [16]. Данная ситуация существенно активирует гемостаз, снижает эффективность микроциркуляции и интенсивность обмена веществ во всех тканях [23]. Вместе с тем состояние спонтанной агрегации и цитоархитектоники эритроцитов на самых ранних этапах развития дислипидемии, способной вести к атеросклерозу, остается изучено весьма недостаточно.

Учитывая, что микрореологические свойства эритроцитов могут легко нарушаться, а в условиях ослабления с возрастом многих адаптационных механизмов [2] это способно привести к созданию условий для окклюзии различных сосудов [4], представляет большой практический интерес проведение экспериментальных работ по подробному изучению влияния дислипидемии на эритроциты. Большой интерес для клиницистов и патофизиологов имеет выявление наиболее ранних нарушений микрореологических свойств эритроцитов. Это диктует потребность проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных с моделированием у них дислипидемии в ходе их старения.

Цель исследования. Проследить на крысах старших возрастов особенности динамики микрореологических свойств эритроцитов в модели дислипидемии.

Материалы и методы . Проведенная работа выполнена в строгом соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006), и одобрена локальным этическим комитетом Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания животных (протокол № 11 от 04.12.2015).

Исследование выполнено на крысах линии «Вистар», которые были получены в 2-месячном возрасте из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Московская область, г. Пущино). Все животные были здоровы на протяжении всего времени, предшествовавшего взятию под наблюдение, и ранее не участвовали ни в каких экспериментах. Опытная группа представлена 105 здоровыми крысами-самцами (12-месячного возраста – 34 крысы, 18-месячного возраста – 32 крысы и 24-месячного возраста – 39 крыс), у которых алиментарным путем формировали дислипидемию. Крысы помещались в тесные клетки по 1 особи на 30 сут и начинали получать высококалорийную диету, состоящую из комбикорма (47 %), сладкого сгущенного молока (44 %), растительного масла (8 %) и растительного крахмала (1 %), что обеспечило следующий состав их рациона: жиры – 29,6 %, протеины – 14,8 %, углеводы – 55,6 % [24]. Группу контроля составила 91 здоровая крыса-самец, в т.ч. 30 животных 12-месячного возраста, 32 крысы 18-месячного и 29 животных 24-месячного возраста. Они получали комбикорм ПК-120 производства «Лаборатор-корм» (Россия) в полном объеме и не подвергались воздействиям.

Формирование возрастных групп наблюдения и группы контроля для данного исследования производилось путем случайного вылавливания крыс из клеток, в которых содержались животные одного возраста, после затемнения клеток для устранения субъективного фактора исследователя.

Концентрации общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) в крови животных выявлялись при помощи энзиматического колориметрического метода с использованием набора производства «Витал Диагностикум» (Россия). Содержание в плазме ХС липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) определялось при помощи набора производства «Ольвекс Диагностикум» (Россия) энзиматическим колориметрическим методом. Концентрацию ХС липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) устанавливалась расчетным путем по формуле W. Friedwaldetal (1972). Концентрация ХС липопротеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) вычислялась по формуле

ХС ЛПОНП=концентрация ТГ/2,2.

В плазме оценивалось количество продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрациям тиобарбитуровой кислоты (ТБК)-активных продуктов набором «Агат-Мед» (Россия) и ацилгидроперекисей (АГП) [25]. Устанавливалась антиоксидантная активность (АОА) плазмы [26]. В эритроцитах после их отмытия и ресуспендирования определялось количество продуктов ПОЛ – малонового диальдегида и ацилгидроперекисей, а также активность эритроцитарных антиоксидантных ферментов – каталазы и суперок-сиддисмутазы [25].

Состояние агрегационной активности отмытых и ресуспендированных эритроцитов выяснялось в ходе световой микроскопии в камере Горяева путем регистрации количества агрегатов эритроцитов, числа агрегированных и неагрегированных эритроцитов [27]. Цитоархитектоника эритроцитов оценивалась путем фазово-контрастной микроскопии на световом микроскопе «Люмам-Р1» («ЛОМО», Россия) под иммерсией с типиро-ванием красных кровяных телец на дискоци-ты, обратимо измененные и необратимо измененные формы [27].

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. У наблюдаемых крыс по мере увеличения возраста выявлено усиление характерных внешних признаков старения: потускнение шерсти, ее поредение, снижение активности и аппетита, отсутствие интереса к окружающему, бледность видимых слизистых.

С увеличением возраста достоверных изменений в липидном составе плазмы крови у контрольных крыс не обнаружено. У опытных крыс выраженность дислипидемии усиливалась по мере увеличения возраста ее создания и была максимальной у 24-месячных животных (табл. 1). Так, у этих опытных крыс содержание в крови общего ХС оказалось повышено в наибольшей степени по сравнению с контролем (в 1,4 раза). Атерогенные фракции холестерина (ХС ЛПНП, ХС

ЛПОНП и ТГ) в их крови также оказались увеличены максимально при наиболее глубоком понижении ХС ЛПВП (на 19,7 %).

У контрольных животных на фоне увеличения возраста отмечено некоторое повышение активности свободнорадикального окисления липидов в жидкой части крови (в 12 мес.: ацилгидроперекиси – 1,520±0,018 Д 233 /1 мл, ТБК-ак-тивные продукты – 3,610±0,022 мкмоль/л, в 24 мес.: 1,950±0,033Д 233 /1 мл и 4,220± ±0,042 мкмоль/л соответственно). Это сопровождалось понижением антиоксидантной активности плазмы с 32,60±0,24 % в 12 мес. до 26,20±0,27 % в 24 мес.

У наблюдаемых опытных животных на фоне увеличения возраста отмечено более выраженное нарастание активности свободнорадикального окисления липидов в жидкой части крови (в 24 мес.: ацилгидроперекиси – 2,460±0,018 Д 233 /1 мл, ТБК-активные продукты – 5,38±0,026 мкмоль/л) при более глубоком понижении антиоксидантной активности (до 20,10±0,32 % в 24 мес.).

У контрольных животных по мере повышения возраста в эритроцитах отмечено небольшое увеличение уровней ацилгидроперекисей и малонового диальдегида, которые постепенно нарастали с 12 до 24 мес. жизни на 21,5 и 29,3 % соответственно. При этом активность эритроцитарной каталазы у контрольных крыс по мере старения достигла 8300,00±28,39 МЕ/1012 эр., супероксиддисму-тазы эритроцитов – 1660,00±10,86 МЕ/1012 эр. (табл. 1).

У опытных животных отмечено более выраженное усиление ПОЛ в эритроцитах: уровни ацилгидроперекисей и малонового диальдегида нарастали, превалируя у 24-месячных опытных животных на 37,4 и 25,2 % соответственно над показателями контрольных крыс аналогичного возраста. При этом активность эритроцитарной каталазы у опытных крыс в возрасте 24 мес. достигла 7250,0±22,5 МЕ/1012 эр., супероксиддисмута-зы эритроцитов – 1400,00±9,62 МЕ/1012 эр., уступая значениям контрольных крыс этого возраста на 15,7 и 18,6 % соответственно (табл. 1).

По мере увеличения хронологического возраста в крови контрольных животных от- мечено понижение количества дискоцитов до 80,20±0,29 % у 24-месячных крыс, что сопровождалось постепенным небольшим повышением у них количества обратимо и необратимо измененных их форм (табл. 1).

По мере нарастания календарного возраста более выраженное снижение количества дискоцитов в крови (до 69,30±0,15 %) отмечено у опытных 24-месячных животных (табл. 1). Это сопровождалось у них более выраженным увеличением числа обратимо и необратимо измененных их форм (различия по сравнению с контролем составили 39,2 и 73,6 % соответственно).

У крыс, составивших группу контроля, между 12 и 24 мес. жизни выявлено небольшое усиление агрегационной активности эритроцитов с небольшим нарастанием их суммарного включения в агрегаты и понижением числа свободных эритроцитов до 279,30±0,31 (табл. 1).

У опытных животных более выраженное усиление агрегационной активности эритроцитов, нарастание их суммарного включения в агрегаты и понижение числа свободных эритроцитов (до 217,30±0,29) выявлено у 24-месячных крыс (табл. 1) .

В ходе экспериментального создания у крыс дислипидемии в настоящей работе отмечены весьма свойственные для человека [15, 28] гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия, ослабление антиоксидантного потенциала плазмы, сопровождающиеся быстрым повышением в ней количества АГП и ТБК-активных соединений и неизбежным ухудшением метаболизма в тканях. Кроме того, активация процессов ПОЛ в плазме вызывала альтерацию поверхностных структур форменных элементов крови [22], в т.ч. наиболее многочисленной их популяции – эритроцитов.

Наступающие в эксперименте изменения в липидном составе плазмы нарушали соотношение между фракциями липидов мембран эритроцитов, способствуя активации в них ПОЛ. Это быстро изменяло у модельных крыс активность рецепторных и пострецепторных механизмов функционирования эритроцитов. Возникающий липидный дисбаланс в организме приводил также к отрицательной динамике в регуляции в эритроцитах ионного и антиоксидантного статуса, что, несомненно, во многом обеспечивало негативные изменения метаболизма и структурно-функциональных свойств сосудов [29, 30].

На фоне формирования дислипидемии происходило ускоренное повышение числа эритроцитов, потерявших свою двояковогнутую форму, что затрудняло процесс их прохождения через капилляры [20]. Наступающие изменения в эритроцитах вели к нарастанию в крови обратимо и необратимо измененных их форм [31]. Так, в крови экспериментальных крыс 24-месячного возраста оказалось наибольшее количество красных кровяных телец, трансформированных через эхиноцитоз в сферы с появлением на их мембранах шипов различной формы и через сто-мацитоз до односторонне выгнутого диска. Эти эритроциты были способны к ускоренной трансформации до сфероэхиноцита, сфе-ростоматоцита, что в конечном итоге приводило к формированию сфероцита, который вскоре лизировался [27]. Вместе с тем повышение в крови экспериментальных крыс уровня обратимо и необратимо трансформированных эритроцитов вело к усугубляющемуся с возрастом усилению контактов между ними, что проявлялось повышением их агрегационной способности.

Выявленное у экспериментальных крыс по мере старения усиление агрегации эритроцитов во многом обеспечивалось более выраженными, чем в контроле, наступающими изменениями заряда их мембран вследствие более активной деградации на них части гликопротеинов под влиянием интенсивного ПОЛ. Усиление генерации активных форм кислорода в данных условиях обеспечивало у экспериментальных крыс с возрастом окси-дативную альтерацию структур мембраны. Это сопровождалось повреждением у них глобулярных протеинов плазмы, обладающих способностью соединяться в виде «мостиков» между эритроцитами и осуществлять их агрегацию, максимально выраженную у наиболее старых животных. При этом продукты ПОЛ увеличивали порог дезагрегации эритроцитов вследствие стимуляции их сцепления в агрегатах, повышения скорости данного процесса в результате оксидативных по- вреждений протеинов и липидов их мембраны [18].

Становится ясно, что выявленное в условиях дислипидемии усиление с возрастом агрегации эритроцитов у крыс в значительной мере было обеспечено воздействием избытка катехоламинов, концентрация которых при различных неблагополучиях в организме может значительно нарастать [14]. На фоне активации а 1 -рецепторов основным посредником выступают система Са²⁺-кальмодулина и каскад внутриклеточных реакций фосфатидилинозитола. Активация а₂-адренорецепторов приводит к подавлению аденилатциклазы в ходе физиологического влияния рецепторов на Gi-белки. Это вызывало у экспериментальных животных понижение количества циклического аденозинмонофосфата в эритроцитах и стимулировало вход Са²⁺ в них, обеспечивая усиление их агрегации [2].

Выраженное увеличение количества свободно циркулирующих в крови экспериментальных крыс эритроцитарных агрегатов вело к повреждению эндотелиальной выстилки сосудов, способствуя обнажению субэндотелиальных структур, негативно влияющих на процессы гемостаза и реологию крови, что ухудшало трофику тканей и состояние внутренних органов животных [32]. Нарастающее количество свободно циркулирующих агрегатов способно перекрывать часть мелких сосудов, играя большую роль в ослаблении тканевого метаболизма и ускорении процесса старения [10].

Заключение. Экспериментальное создание у крыс разного возраста дислипидемии показало быстрое ослабление антиоксидантной защиты плазмы и раннее усиление в ней ПОЛ, что углублялось по мере увеличения возраста животных. Развивающиеся нарушения у экспериментальных крыс превышали возрастные изменения микрореологических свойств эритроцитов в контроле. Становится ясно, что по мере увеличения возраста необходимо все более строго контролировать уровень липидов крови и избегать создания в организме дисли-пидемической ситуации, с годами становящейся все более опасной в плане ухудшения агрегации и цитоархитектоники эритроцитов и повышения риска развития тромбофилии.