Физиологические особенности гемоцитов Therea olegrandjeani

Способность к саморегуляции объема является важным условием для поддержания функциональной активности гемоцитов. Мембранный резерв представляет собой один из важнейших параметров клеток. Способность противостоять осмотической нагрузке может достигаться различными механизмами в зависимости от рассматриваемого гемоцитарного типа. Преобладание микровозвышений на поверхности плазмалеммы, обилие везикул и лизосом в цитоплазме позволяют фагоцитам демонстрировать устойчивость к осмотическому стрессу и выполнять свою прямую функцию – захват инородных объектов [1, 2].

Использование современных подходов в изучении физиологии клетки позволяет выявить ряд закономерностей, которые могут характеризовать сравнительные аспекты реализации функций клеток лимфоидного ряда в филогенезе. Одним из актуальных направлений исследований является изучение гемоцитарных реакций беспозвоночных животных в условиях экспериментального осмотического стресса.

Цель данного исследования – составить гемоцитарную формулу имаго Therea olegrandjeani, изучить устойчивость каждого гемоцитарного типа к осмотической нагрузке и определить общую жизнеспособность клеток гемолимфы.

Материал и методы исследований. Гемолимфу получали нелетальным способом из кончика усика, делили на 3 равных объема (20 мкл) и помещали в разные условия: изотоническую (0,97 % NaCl), гипертоническую (1,50 % NaCl) и сильно гипотоническую (0,25 % NaCl) среды. Определяли жизнеспособность с помощью автоматического счетчика клеток в каждой группе, спустя 3, 10 и 30 минут инкубации посредством окрашивания трипановым синим. Для регистрации морфологических изменений в эти же временные точки проводили наблюдения с помощью световой микроскопии (Nikon Eclipse Ti-E) с добавлением нейтрального красного красителя в режиме реального времени. Фиксировали исчезновение гемоцитарных типов, нарушение целостности мембран, размеры клеток, характер распределения гранул в клетке. Эксперимент проводили в трех повторностях.

Рассчитаны показатели абсолютного и относительного мембранного резерва. При вычислении площади круглых клеток использовали формулу площади круга, в случае клеток с неправильной формой, принимали их форму за эллипс и использовали формулу площади эллипса.

Рассчитывали абсолютную величину мембранного резерва (∆S) как разность между площадью клетки в сильно гипотоническом растворе и площадью клетки в изотонической среде [3].

AS = S(Cr) - S(И) , (1)

где AS - резерв плазмалеммы (gm²); S(Cr) - площадь клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (gm²); S(H) – площадь клетки, после инкубации в изотонической среде (µm²).

С целью сравнения использования мембранного резерва в сильно гипотоническом растворе гемоцитами насекомых определяли относительный мембранный резерв (MR) с использованием формулы [3]:

MR = (AS/Б(СГ))-100 % , (2)

где MR – доля используемого мембранного резерва (%); AS - резерв плазматической мембраны (gm²); S(Cr) -площадь клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (µm²).

Результат исследований.

Гемоцитарная формула имаго T. olegrandjeani представлена прогемоцитами (11 %), плазмоцитами (23 %), гранулоцитами (44 %), сферулоцитами (16 %), коагулоцитами (6 %).

Линейные параметры прогемоцитов и их ядер после трех минут пребывания в растворе с пониженной осмолярностью сохранились прежними. Спустя 10 минут наблюдения гемоциты погибали из-за разрыва плазмалеммы без предварительного увеличения объема. Ввиду изначально сглаженного микрорельефа прогемоцитов [1], они способны противостоять гипоосомотическому стрессу лишь короткое время.

Отсутствие значимого увеличения размеров прогемоцитов в условиях пониженного осмотического давления, указывает на то, что клетки способны компенсировать отклонение от оптимального физиологического состояния. В этот период активируются механизмы транспорта ионов, реагирующие на малейшее изменение объема клеток, и обеспечивают уменьшение прогемоцитов до прежних размеров [4].

Размеры и морфология плазмоцитов не изменились по истечении трех минут инкубации в условиях пониженной осмолярности. Спустя 10 минут зафиксировано отсутствие псевдоподий и утрата подвижности. При дальнейшем наблюдении в режиме live зафиксировано повреждение лизосомальных мембран – в присутствии нейтрального красного цвет переходил от красного к бурому. Впоследствии происходили видимые разрывы плазмалеммы.

К 10 минуте гранулоциты значительно увеличились в размерах (Рисунок 1), однако ризоподии на поверхности все еще присутсвовали. Окрашенные нейтральным красным красителем клетки сохраняли красный оттенок. К 15-20 минуте площадь 83 % гранулоцитов достигла максимальных значений, у большинства гранулоцитов наблюдали частичное разрушение гранул и отсутствие псевдоподий. Однако в популяции этих гемоцитов оставались клетки меньшего размера без признаков нарушения внутриклеточных мембран. Это свидетельствует о том, что гранулоцитам в отличие от прогемоцитов требуется некоторое время для активации механизмов, позволяющих удалить избыток воды.

По истечении 10 минут диаметр сферулоцитов увеличился всего на 7-10 %. К концу экспериментального периода зафиксировано увеличение линейных параметров клеток на 23 %. Способность компонентов внутриклеточных мембран встраиваться в плазмалемму обеспечивает целостность сферулоцитов.

При попадании в гипотонический раствор коагулоциты немедленно набухали, наблюдались множественные повреждения мембраны и выход содержимого цитоплазмы во внешнюю среду.

Прижизненное окрашивание клеток трипановым синим позволило проанализировать жизнеспособность клеток в условиях осмотического стресса. Контрольный образец гемолимфы инкубировали в изотоническом растворе. Процент живых клеток составил 92,0 %.

Доля неповрежденных гемоцитов после трехминутной инкубации в сильно гипотонической среде составила 75,7 %. Отмеченная неустойчивость прогемоцитов и коагулоцитов позволяет предположить, что именно они оказались в числе погибших клеток. Спустя 10 минут инкубации количество живых клеток не превышало 71 %. К 30 минуте инкубации процент мертвых гемоцитов достиг 73 % (Рисунок 2).

Рисунок 1 – Динамика изменения площади гемоцитов в условиях пониженного осмотического давления. Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями параметров гемоцитов в условиях изотонии и при осмотической нагрузке по критерию Стьюдента при P<0,05

Рисунок 2 – Динамика жизнеспособности клеток при длительной гипоосмотической

нагрузке. «Изо» – изотонический раствор, «Сг» – сильно гипотонический раствор

При определении мембранного резерва учитывали максимальную площадь, зафиксированную для каждого гемоцитарного типа. Мгновенное разрушение коагулоцитов свидетельствует об отсутствии складчатости мембран (Таблица 1).

Таблица 1 – Показатели абсолютного ∆S и относительного мембранного резерва MR гемоцитов

Тип клеток	∆S (µm2)	MR (%)
прогемоциты	3,68	9,2
плазмоциты	87,48	66,77
гранулоциты	61,87	26,27
сферулоциты	29,39	25,24
коагулоциты	0	0

Значительное уменьшение линейных параметров прогемоцитов было хорошо заметно уже в первые минуты пребывания в условиях повышенной осмолярности. К 10 минуте клетки теряли округлые очертания, приобретали неправильную угловатую форму.

После трехминутной инкубации в гипертонической среде диаметр ядер плазмоцитов уменьшился на 8-13 %, лобоподии клеток сменились игольчатыми выростами. По истечении 10 минут происходило дальнейшее уменьшение гемоцитов, их контуры становились нечеткими, ядро не идентифицировалось.

Постепенное уменьшение площади гранулоцитов не привело к снижению жизнеспособности спустя 10 минут пребывания в гипертонической среде. Однако уже к 30 минуте только 32 % гранулоцитов не имели серьезных повреждений и увеличили свои линейные параметры до состояния 93 % от первоначальных размеров (Рисунок 3). Это свидетельствует о запуске процесса регуляторного восстановления объема. Оставшиеся клетки окрашивались трипановым синим.

К 30 минуте пребывания в среде с повышенной осмолярностью отмечено уменьшение размеров сферулоцитов, что привело к более плотному расположению гранул,

Коагулоциты к 10-ой минуте инкубации в гипертонической среде погибали.

Рисунок 3 – Динамика изменения площади гемоцитов в условиях повышенного осмотического давления. Примечание: * – статистически достоверные различия параметров гемоцитов в условиях изотонии и при осмотическом стрессе по критерию Стьюдента при P<0,05

Сферулоциты и некоторые клетки из популяции гранулоцитов T. olegrandjeani проявляют устойчивость в условиях осмотической нагрузки благодаря запуску механизмов регуляторного восстановления объема. При набухании в гипотонической среде клетки могут задействовать элементы микрорельефа поверхности и сеть внутриклеточных мембран для предотвращения повреждений плазмалеммы. Возвращение размеров клеток к физиологической норме обеспечивается активацией путей переноса ионов [2, 4].

В условиях гипертонической нагрузки регуляторное увеличение объема происходит в ответ на малейшее отклонение размеров клеток от физиологической нормы. При оценке общей жизнеспособности в условиях гипертонической нагрузки к третьей минуте инкубации количество живых клеток составило – 91,3 %, к 10 минуте – 57,6 %, к 30 минуте – 32,3 %.

Заключение. В гемолимфе имаго T. olegrandjeani представлено пять гемоцитарных типов. Плазмоциты и гранулоциты играют главную роль в осуществлении защитных реакций. Высокие показатели мембранного резерва связаны с повышенной складчатостью плазмалеммы, что позволяет не только обеспечивать реакции фагоцитоза, но и противостоять пониженному осмотическому давлению. Кроме того, гранулоциты обладают механизмами регуляторного уменьшения объема. Максимальную устойчивость к осмотической нагрузке продемонстрировали сферулоциты. Клетки проявили наибольшую жизнеспособность при десятиминутном воздействии гипотонической среды, нежели гипертонической. Однако спустя 30 минут и в тех, и в других условиях значения выровнялись, и число живых клеток в обоих случаях не превышало 33 %.