Физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp

Введение. В последние несколько десятилетий на юге нашей страны в связи с жаркой и сухой погодой летом наблюдается всё большее распространение экономически значимой вредоносной болезни – сухой гнили подсолнечника, возбудителем которой являются грибы рода Rhizopus Ehrenb. Заражение происходит спорами в фазе цветения через трубчатые цветки или механические повреждения насекомыми-вредителями на корзинке. Поражая корзинку, возбудитель проникает в семена, из-за чего их ядра приобретают горький вкус. Таким образом, болезнь не только снижает урожай подсолнечника, но и наносит вред посевным и товарным качествам семян [1; 2; 3; 4; 5].

В нашей стране основной метод, который используют для снижения вредоносности сухой гнили подсолнечника, химический [6; 7]. Однако резкое возрастание загрязнения окружающей среды и снижение качества сельскохозяйственной продукции послужили мощным стимулом внедрения биологических средств защиты растений во всех странах мира [8]. В России нет микробиологических препаратов, зарегистрированных для защиты подсолнечника от сухой гнили. Однако за рубежом известны микроорганизмы-антагонисты, используемые в качестве биологического контроля возбудителя мягкой гнили плодоовощных культур Rhizopus stolonifer [9; 10; 11; 12].

Основной стадией любого микробиологического производства является производственное культивирование соответствующего микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микробной биомассы, либо для получения продуктов метаболизма микроорганизмов [16]. Для разработки элементов технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок (СП) необходимо оптимизировать условия поверхностного выращивания грибного штамма-продуцента на жидких питательных средах.

Целью настоящей работы было изучение физиологических свойств перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидкой питательной среде и подбор сложных жидких питательных сред для его выращивания.

Материалы и методы. Научные исследования проводили в лаборатории биометода агротехнологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в 2023 г. Объектом исследований служил выделенный в результате ступенчатого скрининга грибной штамм T-5 Trichoderma sp. – антагонист возбудителя сухой гнили подсолнечника Rhizopus oryzae .

Изучали физиологические признаки перспективного штамма-продуцента микробиопрепарата при поверхностном выращивании на жидких питательных средах: оптимальная температура (°С), pH среды, источники азотного и углеродного питания и сложные жидкие питательные среды. Стационарное культивирование штамма осуществляли при температуре +25 °С в течение 10 суток в колбах Эр- ленмейера (250 мл) с объемом питательной среды 100 мл, при этом в каждую колбу высевали одинаковый агаровый блок со штаммом антагонистом.

Определение оптимальных температуры и pH для стационарного выращивания штаммов проводили на жидкой среде Рудакова [17]. Штаммы культивировали при температуре +20, +25, +30 и +35 °С, рН – 3, 6, 8 и 10. При этом необходимую кислотность получали путем добавления в среду лимонной кислоты или щёлочи (NaOH).

Определение оптимальных элементов питания для выращивания перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов проводили на жидкой питательной среде Чапека [18]. Источниками азотного питания служили азотнокислый натрий, мочевина, тиомочевина, кукурузный экстракт, азотнокислый и хлористый аммоний, с неизменным источником углеродного питания – глюкозой. Источниками углеродного питания служили крахмал, глюкоза, маннит и сахароза, при этом неизменным компонентом азотного питания был азотнокислый натрий.

Определение оптимальных сложных жидких питательных сред проводили при стационарном культивировании грибного штамма. Испытывали среды: Рудакова, Сабуро, Чапека, Викерхема и № 1, содержащие углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы [19].

По окончании культивирования штамма определяли сухую массу путем высушивания выращенной мицелиальной пленки при температуре +105 °С до постоянного веса. Повторность в каждом опыте трехкратная.

Результаты и обсуждение. Для учета роста грибного штамма-продуцента микробиопрепарата T-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидких питательных средах в процессе выполнения исследований нами была разработана шкала (рис. 1), где:

0 баллов – отсутствие роста или только обрастание посевного блока;

• 1    балл – рост гриба поверхностный отдельными колониями или обрастание по краю в колбе;

• 2    балла – тонкая и сплошная мицелиальная плёнка;

• 3    балла – толстая, сплошная и складчатая мицелиальная плёнка, с частичным оседанием вглубь среды.

0 баллов              1 балл

2 балла              3 балла

Рисунок 1 – Шкала оценки роста грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. на жидких питательных средах при стационарном культивировании, 2023 г. (ориг.)

При определении оптимальной температуры для стационарного культивирования штамма Т-5 Trichoderma sp. было установлено, что наибольший рост (3 балла) и сухая мицелиальная масса (1,13–1,22 г/100 мл среды) определены при +25–30 °С. Менее благоприятной оказалась температура +20 и +35 °С, где рост гриба был менее обильным (2 балла), а сухая мицелиальная масса составила 0,95–0,98 г/100 мл среды (табл. 1).

Таблица 1

Влияние температуры на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Рудакова

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	температура, °С
	+20	+25	+30	+35
T-5 Tricho-derma sp.	2/0,95 ± 0,06	3/1,13 ± 0,03	/1,22 ± 0,03	/0,98 ±0,03

Следует отметить, что при +30 и +35 °С наблюдалось образование преимущественно белого воздушного мицелия грибного штамма со слабовыраженным конидиальным спороношением по краю в колбе, тогда как при +20 и +25 °С к тому времени на мицелии сформировались типичные многочисленные подушечки спо-роношения зеленого цвета (рис. 2). Поэтому, несмотря на обильный рост и максимальную сухую мицелиальную массу при температуре +30 ºС, оптимальной установлена температура +25 ºС.

+20 ºС

+25 ºС

+30 ºС

Рисунок 2 – Влияние температуры на рост грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидкой питательной среде Рудакова, 2023 г. (ориг.) 104

+35 ºС

При определении оптимальной кислотности среды при стационарном культивировании штамма Т-5 Trichoderma sp. лучшей оказалась среда с высокой кислотностью – рН 3, при которой наблюдался поверхностный рост с обильным спороношением гриба (3 балла) и максимальная сухая мицелиальная масса (1,3 г/100 мл среды) (табл. 2).

Таблица 2

Влияние рН среды на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp.

в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Рудакова

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	рН среды
	3	6	8	10
T-5 Tricho derma sp.	3/1,3 ± 0,11	2/0,50 ± 0,05	0/0,06 ± 0,03	0/0,05 ±0

При понижении кислотности до 6 формировалась тонкая мицелиальная пленка (2 балла), а сухая мицелиальная масса снижалась в 2,6 раз – 0,5 г/100 мл среды. В щелочной среде при рН в диапазоне от 8 до 10 поверхностный рост гриба полностью отсутствовал, а сухая масса соответствовала весу посевного блока. Поэтому оптимальной установлена кислотность среды рН 3.

Для определения оптимальных источников азотного и углеродного питания грибной штамм стационарно выращивали на жидкой синтетической питательной среде Чапека при температуре +25 оС (табл. 3).

Установлено, что лучшими источниками углерода были глюкоза и крахмал, при добавлении которых на среде Чапека штамм Т-5 Trichoderma sp. формировал соответственно сплошную тонкую поверхностную пленку (2 балла) и рос отдельными колониями (1 балл) при сухой мицелиальной массе 0,34–0,33 г/100 мл среды. В вариантах с добавлением маннита и сахарозы поверхностный рост гриба отсутствовал, а сухая мицелиальная масса в сравнении с глюкозой и крахмалом снижалась в 2,4–3,7 раза (0,14–0,09 г/100 мл среды).

Таблица 3

Влияние источников углеродного и азотного питания на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Чапека при температуре +25 ºС

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	Источник углеродного питания
	крахмал	глюкоза		сахароза		маннит
T-5 Tricho-derma sp.	1/0,34 ± 0,02	2/0,33 ± 0,01		0/0,09 ± 0,02		0/0,14 ±0,06
	Источник азотного питания
	хлористый аммо ний	мочевина	тиомо чевин	кукуруз - ный экстракт	азотнокислый аммоний		азотнокислый натрий
	1/0,20 ± 0	1/0,20 ± 0,01	0/0,07 0	± 2/0,43 ± 0,03	1/0,20 ± 0,01		2/0,33 ± 0,01

Оптимальным источником азотного питания для грибного штамма определен кукурузный экстракт, при добавлении которого отмечен наилучший поверхностный рост мицелия (2 балла) и наибольшая сухая мицелиальная масса (0,43 г/100 мл среды). Несколько меньшая сухая мицелиальная масса (0,33 г/100 мл среды) при одинаковом поверхностном росте мицелия гриба (2 балла) отмечена в варианте с добавлением в качестве источника азота азотнокислого натрия. При добавлении в среду мочевины, хлористого и азотнокислого аммония наблюдалось слабое развитие поверхностного роста штамма Т-5 Trichoderma sp. (1 балл), а сухая мицелиальная масса составила 0,20 г/100 мл среды. В варианте с тиомочевинной поверхностный рост мицелия отсутствовал при минимальной сухой мицелиальной массе 0,07 г/100 мл среды.

Подобраны оптимальные сложные жидкие питательные среды для поверхностного выращивания грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. На всех сложных жидких питательных средах (Рудакова, Сабуро, Чапека, Викерхема и № 1) гриб формировал хорошо развитый поверхностный мицелий с обильным спороно-шением (2 и 3 балла) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние сложных жидких питательных сред на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования при температуре +25 ºС

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	сложные жидкие питательные среды
	Рудакова	Сабуро	№ 1	Чапека	Викер-хема
T-5 Tricho-	3/1,29 ±	2/0,35 ±	3/1,13 ±	2/0,33 ±	3/0,98 ±
derma sp.	0,05	0,03	0,01	0,01	0,05

Лучшими средами, на которых гриб сформировал плотный поверхностный мицелий (3 балла) с максимальной сухой мицелиальной массой – 1,29 и 1,13 г/100 мл среды, оказались Рудакова и № 1. Среда Викерхема хоть и уступала вышеупомянутым средам, однако превзошла Чапека и Сабуро по развитию поверхностной мицелиальной пленки (3 балла против 2) и сухой мицелиальной массе в 3 раза (0,98 против 0,33 и 0,35 г/100 мл соответственно).

Заключение. Изучены физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника Т-5 Trichoderma sp., а также подобраны оптимальные сложные жидкие питательные среды для стационарного культивирования.

Оптимальной температурой поверхностного культивирования гриба Т-5 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова установлена +25 °С; оптимальная реакция среды кислая (рН 3); лучшими источниками углерода установлены глюкоза и крахмал, а источником азотного питания – кукурузный экстракт; лучшими сложными жидкими питательными средами определены Рудакова и № 1.