Физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp

Автор: Дейнега Л.А., Маслиенко Л.В., Ефимцева Е.А.

Журнал: Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур @vniimk

Рубрика: Агрохимия, агропочвоведение, защита и карантин растений

Статья в выпуске: 1 (197), 2024 года.

Бесплатный доступ

Сухая гниль - одна из наиболее распространенных и вредоносных болезней подсолнечника в последние годы. Ввиду нарастающей востребованности экологически безопасного производства сельскохозяйственной продукции, повышается спрос на конкурентоспособные микробиопрепараты. В лаборатории биометода агротехнологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК с 2020 г. проводятся исследования по разработке экологически безопасных микробиопрепаратов полифункционального типа действия против возбудителя сухой гнили подсолнечника Rhizopus oryzae Went & Prins. Geerl. С целью разработки элементов технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе выделенного в результате ступенчатого скрининга перспективного штамма антагониста возбудителя сухой гнили T-5 Trichoderma sp. были изучены его физиологические свойства при стационарном культивировании на жидких питательных средах. Оптимальными условиями для поверхностного выращивания гриба Т-5 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде определены: температура +25 °С; реакция среды кислая (рН 3); источник углерода - глюкоза и крахмал; источник азотного питания - кукурузный экстракт. Лучшими сложными жидкими питательными средами установлены Рудакова и № 1.

Еще

Сухая гниль подсолнечника, антагонист, t-5 trichoderma sp, стационарное культивирование, физиологические признаки, сложные жидкие питательные среды, микробиопрепарат

Короткий адрес: https://sciup.org/142241292

IDR: 142241292 | DOI: 10.25230/2412-608X-2024-1-197-101-107

Текст научной статьи Физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp

Введение. В последние несколько десятилетий на юге нашей страны в связи с жаркой и сухой погодой летом наблюдается всё большее распространение экономически значимой вредоносной болезни – сухой гнили подсолнечника, возбудителем которой являются грибы рода Rhizopus Ehrenb. Заражение происходит спорами в фазе цветения через трубчатые цветки или механические повреждения насекомыми-вредителями на корзинке. Поражая корзинку, возбудитель проникает в семена, из-за чего их ядра приобретают горький вкус. Таким образом, болезнь не только снижает урожай подсолнечника, но и наносит вред посевным и товарным качествам семян [1; 2; 3; 4; 5].

В нашей стране основной метод, который используют для снижения вредоносности сухой гнили подсолнечника, химический [6; 7]. Однако резкое возрастание загрязнения окружающей среды и снижение качества сельскохозяйственной продукции послужили мощным стимулом внедрения биологических средств защиты растений во всех странах мира [8]. В России нет микробиологических препаратов, зарегистрированных для защиты подсолнечника от сухой гнили. Однако за рубежом известны микроорганизмы-антагонисты, используемые в качестве биологического контроля возбудителя мягкой гнили плодоовощных культур Rhizopus stolonifer [9; 10; 11; 12].

Основной стадией любого микробиологического производства является производственное культивирование соответствующего микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микробной биомассы, либо для получения продуктов метаболизма микроорганизмов [16]. Для разработки элементов технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок (СП) необходимо оптимизировать условия поверхностного выращивания грибного штамма-продуцента на жидких питательных средах.

Целью настоящей работы было изучение физиологических свойств перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидкой питательной среде и подбор сложных жидких питательных сред для его выращивания.

Материалы и методы. Научные исследования проводили в лаборатории биометода агротехнологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в 2023 г. Объектом исследований служил выделенный в результате ступенчатого скрининга грибной штамм T-5 Trichoderma sp. – антагонист возбудителя сухой гнили подсолнечника Rhizopus oryzae .

Изучали физиологические признаки перспективного штамма-продуцента микробиопрепарата при поверхностном выращивании на жидких питательных средах: оптимальная температура (°С), pH среды, источники азотного и углеродного питания и сложные жидкие питательные среды. Стационарное культивирование штамма осуществляли при температуре +25 °С в течение 10 суток в колбах Эр- ленмейера (250 мл) с объемом питательной среды 100 мл, при этом в каждую колбу высевали одинаковый агаровый блок со штаммом антагонистом.

Определение оптимальных температуры и pH для стационарного выращивания штаммов проводили на жидкой среде Рудакова [17]. Штаммы культивировали при температуре +20, +25, +30 и +35 °С, рН – 3, 6, 8 и 10. При этом необходимую кислотность получали путем добавления в среду лимонной кислоты или щёлочи (NaOH).

Определение оптимальных элементов питания для выращивания перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов проводили на жидкой питательной среде Чапека [18]. Источниками азотного питания служили азотнокислый натрий, мочевина, тиомочевина, кукурузный экстракт, азотнокислый и хлористый аммоний, с неизменным источником углеродного питания – глюкозой. Источниками углеродного питания служили крахмал, глюкоза, маннит и сахароза, при этом неизменным компонентом азотного питания был азотнокислый натрий.

Определение оптимальных сложных жидких питательных сред проводили при стационарном культивировании грибного штамма. Испытывали среды: Рудакова, Сабуро, Чапека, Викерхема и № 1, содержащие углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы [19].

По окончании культивирования штамма определяли сухую массу путем высушивания выращенной мицелиальной пленки при температуре +105 °С до постоянного веса. Повторность в каждом опыте трехкратная.

Результаты и обсуждение. Для учета роста грибного штамма-продуцента микробиопрепарата T-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидких питательных средах в процессе выполнения исследований нами была разработана шкала (рис. 1), где:

0 баллов – отсутствие роста или только обрастание посевного блока;

1 балл – рост гриба поверхностный отдельными колониями или обрастание по краю в колбе;
2 балла – тонкая и сплошная мицелиальная плёнка;
3 балла – толстая, сплошная и складчатая мицелиальная плёнка, с частичным оседанием вглубь среды.

0 баллов 1 балл

2 балла 3 балла

Рисунок 1 – Шкала оценки роста грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. на жидких питательных средах при стационарном культивировании, 2023 г. (ориг.)

При определении оптимальной температуры для стационарного культивирования штамма Т-5 Trichoderma sp. было установлено, что наибольший рост (3 балла) и сухая мицелиальная масса (1,13–1,22 г/100 мл среды) определены при +25–30 °С. Менее благоприятной оказалась температура +20 и +35 °С, где рост гриба был менее обильным (2 балла), а сухая мицелиальная масса составила 0,95–0,98 г/100 мл среды (табл. 1).

Таблица 1

Влияние температуры на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Рудакова

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	температура, °С
	+20	+25	+30	+35
T-5 Tricho-derma sp.	2/0,95 ± 0,06	3/1,13 ± 0,03	/1,22 ± 0,03	/0,98 ±0,03

Следует отметить, что при +30 и +35 °С наблюдалось образование преимущественно белого воздушного мицелия грибного штамма со слабовыраженным конидиальным спороношением по краю в колбе, тогда как при +20 и +25 °С к тому времени на мицелии сформировались типичные многочисленные подушечки спо-роношения зеленого цвета (рис. 2). Поэтому, несмотря на обильный рост и максимальную сухую мицелиальную массу при температуре +30 ºС, оптимальной установлена температура +25 ºС.

+20 ºС

+25 ºС

+30 ºС

Рисунок 2 – Влияние температуры на рост грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. при стационарном культивировании на жидкой питательной среде Рудакова, 2023 г. (ориг.) 104

+35 ºС

При определении оптимальной кислотности среды при стационарном культивировании штамма Т-5 Trichoderma sp. лучшей оказалась среда с высокой кислотностью – рН 3, при которой наблюдался поверхностный рост с обильным спороношением гриба (3 балла) и максимальная сухая мицелиальная масса (1,3 г/100 мл среды) (табл. 2).

Таблица 2

Влияние рН среды на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp.

в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Рудакова

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	рН среды
	3	6	8	10
T-5 Tricho derma sp.	3/1,3 ± 0,11	2/0,50 ± 0,05	0/0,06 ± 0,03	0/0,05 ±0

При понижении кислотности до 6 формировалась тонкая мицелиальная пленка (2 балла), а сухая мицелиальная масса снижалась в 2,6 раз – 0,5 г/100 мл среды. В щелочной среде при рН в диапазоне от 8 до 10 поверхностный рост гриба полностью отсутствовал, а сухая масса соответствовала весу посевного блока. Поэтому оптимальной установлена кислотность среды рН 3.

Для определения оптимальных источников азотного и углеродного питания грибной штамм стационарно выращивали на жидкой синтетической питательной среде Чапека при температуре +25 оС (табл. 3).

Установлено, что лучшими источниками углерода были глюкоза и крахмал, при добавлении которых на среде Чапека штамм Т-5 Trichoderma sp. формировал соответственно сплошную тонкую поверхностную пленку (2 балла) и рос отдельными колониями (1 балл) при сухой мицелиальной массе 0,34–0,33 г/100 мл среды. В вариантах с добавлением маннита и сахарозы поверхностный рост гриба отсутствовал, а сухая мицелиальная масса в сравнении с глюкозой и крахмалом снижалась в 2,4–3,7 раза (0,14–0,09 г/100 мл среды).

Таблица 3

Влияние источников углеродного и азотного питания на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде Чапека при температуре +25 ºС

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	Источник углеродного питания
	крахмал	глюкоза		сахароза		маннит
T-5 Tricho-derma sp.	1/0,34 ± 0,02	2/0,33 ± 0,01		0/0,09 ± 0,02		0/0,14 ±0,06
	Источник азотного питания
	хлористый аммо ний	мочевина	тиомо чевин	кукуруз ^- ный экстракт	азотнокислый аммоний		азотнокислый натрий
	1/0,20 ± 0	1/0,20 ± 0,01	0/0,07 0	± 2/0,43 ± 0,03	1/0,20 ± 0,01		2/0,33 ± 0,01

Оптимальным источником азотного питания для грибного штамма определен кукурузный экстракт, при добавлении которого отмечен наилучший поверхностный рост мицелия (2 балла) и наибольшая сухая мицелиальная масса (0,43 г/100 мл среды). Несколько меньшая сухая мицелиальная масса (0,33 г/100 мл среды) при одинаковом поверхностном росте мицелия гриба (2 балла) отмечена в варианте с добавлением в качестве источника азота азотнокислого натрия. При добавлении в среду мочевины, хлористого и азотнокислого аммония наблюдалось слабое развитие поверхностного роста штамма Т-5 Trichoderma sp. (1 балл), а сухая мицелиальная масса составила 0,20 г/100 мл среды. В варианте с тиомочевинной поверхностный рост мицелия отсутствовал при минимальной сухой мицелиальной массе 0,07 г/100 мл среды.

Подобраны оптимальные сложные жидкие питательные среды для поверхностного выращивания грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. На всех сложных жидких питательных средах (Рудакова, Сабуро, Чапека, Викерхема и № 1) гриб формировал хорошо развитый поверхностный мицелий с обильным спороно-шением (2 и 3 балла) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние сложных жидких питательных сред на рост перспективного грибного штамма Т-5 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования при температуре +25 ºС

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2023 г.

Штамм	Рост гриба, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	сложные жидкие питательные среды
	Рудакова	Сабуро	№ 1	Чапека	Викер-хема
T-5 Tricho-	3/1,29 ±	2/0,35 ±	3/1,13 ±	2/0,33 ±	3/0,98 ±
derma sp.	0,05	0,03	0,01	0,01	0,05

Лучшими средами, на которых гриб сформировал плотный поверхностный мицелий (3 балла) с максимальной сухой мицелиальной массой – 1,29 и 1,13 г/100 мл среды, оказались Рудакова и № 1. Среда Викерхема хоть и уступала вышеупомянутым средам, однако превзошла Чапека и Сабуро по развитию поверхностной мицелиальной пленки (3 балла против 2) и сухой мицелиальной массе в 3 раза (0,98 против 0,33 и 0,35 г/100 мл соответственно).

Заключение. Изучены физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника Т-5 Trichoderma sp., а также подобраны оптимальные сложные жидкие питательные среды для стационарного культивирования.

Оптимальной температурой поверхностного культивирования гриба Т-5 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова установлена +25 °С; оптимальная реакция среды кислая (рН 3); лучшими источниками углерода установлены глюкоза и крахмал, а источником азотного питания – кукурузный экстракт; лучшими сложными жидкими питательными средами определены Рудакова и № 1.

Список литературы Физиологические свойства перспективного грибного штамма антагониста возбудителя сухой гнили подсолнечника T-5 Trichoderma sp

Бородин С.Г., Котлярова И.А., Соснина Ю.М. Грибы рода Rhizopus Ehrenb. на подсолнечнике // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. – 2007. – Вып. 2 (137). – С. 55–57.
Бородин С.Г., Котлярова И.А., Терещенко Г.А., Соснина Ю.М. Сухая гниль подсолнечника и дополнительные дифференцирующие признаки видов рода Rhizopus Erhenb. // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. – 2013. – Вып. 1 (153–154). – С. 124–131.
Бородин С.Г., Котлярова И.А. Грибные болезни подсолнечника в Краснодарском крае // Болезни и вредители масличных культур: сб. науч. работ. – Краснодар: ВНИИМК, 2006. – С. 3–10.
Иванченко М.Я. Сухая гниль подсолнечника и способы снижения ее вредоносности // Материалы VII Международной конференции. – 1978. – С. 356–358.
Котлярова И.А., Хатит А.Б. Влияние возбудителей на качество семян подсолнечника // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. – 2000. – Вып. 123. – С. 32–35.
Вошедский Н.Н., Пасько Т.И. Эффективность фунгицидов против сухой гнили подсолнечника // Международный журнал гуманитарных и естественных наук. – 2018. – № 2. – С. 103–105.
Гниль сухая корзинок подсолнечника: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.pesticidy.ru/Гниль_сухая_корзинок _подсолнечника.
Азизбекян Р.Р. Биологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений (обзор) // Биотехнология. – 2018. – Т. 34. – № 5. – С. 37–47.
Bonaterra А., Mari М., Casalini L., Mon-tesinos E. Biological control of Monilinia laxa and Rhizopus stolonifer in postharvest of stone fruit by Pantoea agglomerans EPS125 and puta-tive mechanisms of antagonism // Int. J. Food Microbiol. – 2003. – 84 – Р. 93–104. DOI: 10.1016/S0168-1605(02)00403-8.
Wang X., Wang J., Jin P., Zheng Y. Inves-tigating the efficacy of Bacillus subtilis SM21 on controlling Rhizopus rot in peach fruit // Int. J. Food Microbiol. – 2013. – 164. – Р. 141–147. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.04.010.
Batta Y.A. Control of postharvest diseases of fruit with an invert emulsion formulation of Trichoderma harzianum Rifai // Postharvest Bi-ol. Technol. – 2007. – 43. – Р. 143–150. DOI: 10.1016/j.postharvbio.2006.07.010.
Nunes C., Usall J., Teixidó N., Fons E., Viñas I. Post‐harvest biological control by Pantoea agglomerans (CPA‐2) on Golden Delicious apples // J. Appl. Microbiol. – 2002. – 92. – Р. 247–255. DOI: 10.1046/j.1365-2672. 2002.01524.x
Maslienko L., Datsenko L. and Efimtseva E. Primary screening of fungal antagonist strains from the collection of V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops against the sun-flower dry rot pathogen Rhizopus oryzae // AIP Conference Proceedings. – 2023. – 2777. – Art. No 020013. DOI: 10.1063/5.0140254.
Maslienko Lyubov, Datsenko Lyubov and Efimtseva Evgeniya. Primary screening of bacterial antagonist strains to the sunflower dry rot pathogen Rhizopus oryzae // AIP Conference Proceedings. – 2023. – 2817. – Art. No 020059. DOI: 10.1063/5.0148452.
Дейнега Л.А., Маслиенко Л.В., Ефимцева Е.А. Способность перспективных штаммов антагонистов возбудителя сухой гнили Rhizo-pus oryzae колонизировать растущий корень подсолнечника на фоне искусственного заражения проростков в лабораторных условиях // Мат-лы XI междунар. науч.-практ. конф.: «Защита растений от вредных организмов», 19–23 июня 2023 г. – Краснодар, 2023. – Вып. 11. – С. 117–119.
Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. – 264 с.
Рудаков О.Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. – М.: Наука, 1981. – 160 с.
Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1984. – 26 с.
Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. … д-ра биол. наук / Любовь Васильевна Масли-енко. – Краснодар, 2005. – 49 с.

Еще

Статья научная