Фомоз (Phoma macdonaldii boerema) в семенах подсолнечника

Введение. Фомоз, или черная стеблевая пятнистость, возбудителем которого является Phoma macdonaldii Boerema [1], teleomorph Leptosphaeria lindquistii Frezzi [2], – одна из наиболее распространенных болезней подсолнечника во Франции, Сербии, Югославии, Румынии, Болгарии, Аргентине, Канаде, Китае и других странах [3]. Распространению фомоза в России способствовало расширение посевных площадей подсолнечника, которое в 2014 г. достигло свыше 7 млн га, а также применение севооборотов короткой ротации, на фоне изменения климата в сторону повышения температуры и влажности. В результате накопления инфекции на растительных остатках может происходить быстрое формирование биотипов грибов высокой агрессивности [4]. Одной из причин распространения фомоза может быть и увеличивающийся в последние годы импорт инфицированного семенного материала. На вероятность распро-107

странения возбудителя фомоза с семенами указывали многие учёные [5; 7].

В Пакистане возбудитель фомоза Phoma oleracea Sacc. впервые был выделен из семян подсолнечника в 2005 г., и сделано заключение о влиянии инфекции на их всхожесть [5]. Исследования 2008 г. образцов семян подсолнечника, полученных из разных мест возделывания в Сербии, показали отсутствие в семенной микрофлоре грибов из рода Phoma Sacc., и был сделан вывод, что семена не могут служить источником распространения болезни [6]. В 2014 г. Maširević с соавторами обнаружили гриб Phoma macdonaldii Boerema в необработанных фунгицидами семенах различных гибридов подсолнечника, частота его встречаемости составляла 1,2–3,5 % [7]. Аналогичный процент заражённых семян (0,25–3,25 %) был подтвержден исследователями Югославии [8]. В Китае выделен возбудитель фомоза гриб P. macdo-naldii из семян подсолнечника и установлена связь распространения болезни с импортом семян для коммерческих посевов из других стран [9].

В Российской Федерации микрофлора семян подсолнечника изучалась многими авторами. По данным Ментюкова Н.С., за период с 2001 по 2003 гг. в трёх зонах Волгоградской области была установлена высокая инфицированность семян подсолнечника патогенными грибами Alter-naria spр., Fusarium spр., Sclerotinia sclerotiorum , и Sclerotium bataticola . Однако не было описано поражение семян подсолнечника фомозом [10]. Пивень В.М. и Мурадасилова Н.В. [11] при проведении ряда опытов по патогенной микрофлоре семян подсолнечника, выращенных в условиях Западного Предкавказья, отмечали, что выделялись многие фитопатогенные грибы, но не упоминали о присутствии грибов из рода Phoma Sacc. Тогда как в Тамбовской области в 2010 г. на сортоиспытательной станции был выделен возбудитель болезни P. macdonaldii из семян сортов и гибридов подсолнечника российской и зарубежной селекции [12].

Разноречивость литературных сведений о возможности распространения возбудителя фомоза семенами и его видовой принадлежности свидетельствует о недостаточной изученности этих вопросов.

Цель нашего исследования уточнить видовую принадлежность гриба из рода Phoma Sacc., выделенного из образцов семян подсолнечника, выращенных в Волгоградской области Российской Федерации.

Материалы и методы. Научные исследования проводили в лаборатории иммунитета и молекулярного маркирования. Для анализа семян на семенную инфекцию использовали методику Наумовой [13]. Из каждой партии произвольно отбирали по 100 семян, раскладывали в стерильные одноразовые пластмассовые чашки Петри на голодный агар по 10 штук и инкубировали в течение 10 дней при температуре +25 °С в термостате. На второй и последующие дни семена просматривали с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 для выявления микрофлоры.

Возбудителей болезней идентифицировали по морфологическим признакам. Измерение пикнид и пикноспор возбудителя фомоза под световым микроскопом Motic BA 310 выполняли при помощи окуляр-микрометра [14]. По систематикам Билай, Пидопличко, Boerema et al. определяли видовую принадлежность фи-топатогенных грибов [1; 15; 16].

Распространенность или частоту встречаемости пораженных возбудителем фомоза семянок подсолнечника вычисляли по формуле:

Р _ п х 10 0 — N , где P – распространенность поражённых семянок, %;

N – общее количество семянок в пробе;

n – количество поражённых семянок в пробе;

100 – коэффициент для пересчета в проценты.

Результаты и обсуждение. В лаборатории иммунитета и молекулярного маркирования ежегодно проводится работа по изучению микробиоты партий семян подсолнечника. В течение трех лет (2015– 2017 гг.) было проанализировано 40 партий семян подсолнечника из ООО «Солнечная страна» Волгоградской области на наличие патогенной микрофлоры. Распространённость грибов зависела от складывающихся погодных условий, в которых возделывался подсолнечник исследуемых партий семян. В исследованных семенах изученных лет преобладали виды грибов рода Alternaria spp. Nees, вызывающие альтернариоз подсолнечника. По литературным данным и нашим наблюдениям, грибы этого рода встречаются наиболее часто на семенах подсолнечника [10; 11; 18]. Распространённость возбудителей других вредоносных болезней: Fusarium spp. Link. (фузариоз), Botry-tis cinerea Pers. (серая гниль), Rhisopus spр. Ehren. (сухая гниль), Phomopsis helianthi Munt.-Čvet. et al. (фомопсис), Phoma sp. Sacc. (фомоз) и бактериоза была в эти годы невысокой. В 2015 г. развитие бактериозов на семянках составляло 13,88 %. В последующие годы количество инфицированных бактериями семянок было в 3–4 раза меньше. Микробиота семян в 2015 г. была представлена Alternaria spp. – 5,15 %, Fusarium spp. – 0,15 и Rhisopus spр.– 0,55 %. В 2016 и 2017 гг. распространённость возбудителей альтернариоза на семенах была выше бактериальных. Частота встречаемости в партиях семян возбудителей фузариоза и фомоза была менее 1 %, так, возбудитель фомоза был выявлен с частотой встречаемости 0,33 % и 0,17 % соответственно (таблица).

Таблица

Частота встречаемости семянок, поражённых возбудителями болезней, в партиях семян подсолнечника из Волгоградской области, %

Год	Всего партий семян, шт.	Всего семян, шт.	Поражено, %
			Alter-naria spp.	Fusarium spp.	Rhi-so-pus spр .	Pho-ma sp.	Phomopsis heli-anthi	Bo-trytis cine-rea	Бак-терии
2015	13	1300	5,15	0,15	0,55	0	0	0	13,88
2016	9	900	36,22	0,22	0,11	0,33	1,55	6,0	3,55
2017	18	1800	15,83	0,17	0,10	0,17	1,28	0,22	4,12

Из этих партий путём визуального анализа были отобраны семянки с пикнидами фомоза. Около 5000 семянок были просмотрены под стереоскопическим микроскопом для обнаружения репродуктивных органов возбудителя болезни. В основном пикниды располагались хаотично под слоем эпидермиса околоплодника (лузги) на расширенной части семянки (рис. 1).

Рисунок 1 – Семянка подсолнечника с пикнидами возбудителя фомоза Phoma macdonaldi Boerema на лузге под эпидермисом (ориг.)

Для идентификации видовой принадлежности возбудителя семена подсолнечника, пораженные фомозом, раскладывали на голодный агар в чашки Петри. На 3–4-й день на семенах появлялся белый мицелий с сероватыми тяжами. Семена с таким мицелием изолировали в отдельные чашки Петри на питательную среду овсяный агар (ОА). Изолирование проводили для того, чтобы исключить постороннюю микробиоту. Через три дня на семянке и на воздушном мицелии образовывались округлые пикниды с плотной коричневой до черного цвета оболочкой (рис. 1). Под лузгой в местах проникновения патогена можно было обнаружить некроз на семядолях. Побурение тканей зародышевого корешка свидетельствовало о начале патологического процесса и о наличии в них инфекционного начала возбудителя болезни. Через 7–10 дней мицелий и образовавшиеся пикниды плотно покрывали лузгу и появившийся проросток, который в дальнейшем загнивал. Через апикальный остиол (отверстие) пикнид при созрева- нии выделялся экссудат грязно-белого или бело-розового цвета (рис. 2).

Рисунок 2 – Пикниды возбудителя фомоза Phoma macdonaldi Boerema на воздушном мицелии и семянке подсолнечника с выходящим экссудатом (показан стрелками) при их созревании (ориг.)

Пикниды с небольшим слоем эпидермиса переносили иглой на предметное стекло. Размеры пикнид, образовавшихся на лузге, составляли 70–200 мк, а на воздушном мицелии пикниды были меньше 35–170 мк (рис. 2). При микроскопическом анализе были видны пикноспоры гриба. Пикноспоры бесцветные, одноклеточные, большей частью яйцевидноэллипсоидальные, их размеры составили 4,5–10 × 1,5–3,6 мк (рис. 3).

Рисунок 3 – Пикноспоры гриба Phoma macdonaldii Boerema (4,5–10 × 1,5–3,6 мк) (ориг.)

По систематике Boerema et al. (2004) размеры репродуктивных органов возбудителя фомоза Phoma sp. Sacc., выделен- ного из семян подсолнечника, соответствуют виду Phoma macdonaldii. Результаты исследований согласуются с описанными в литературе фактами встречаемости Phoma macdonaldii на семенах подсолнечника [18]. То, что на семянках и вегетирующих растениях подсолнечника был обнаружен один и тот же вид возбудителя фомоза, свидетельствует о возможности распространения болезни инфицированными семенами [17].

Вывод. Таким образом, определена видовая принадлежность гриба из рода Phoma Sacc., выделенного из образцов семян подсолнечника Волгоградской области. При визуальном осмотре семянок поражёнными считали те, на которых присутствовали пикниды гриба под слоем эпидермиса. Размеры репродуктивных органов гриба по систематике Boerema et al. (2004) соответствовали Phoma macdonaldii . Наличие репродуктивных органов гриба Phoma macdonaldii на семянках означает, что в определённых условиях зараженные семена подсолнечника способствуют распространению фомоза.