Формирование эндотелиальной дисфункции при осложненном течении послеоперационного периода при уролитиазе

Мочекаменная болезнь продолжает занимать лидирующее место в повседневной практике врача-уролога. Актуальность проблемы изучения мочекаменной болезни обусловлена широкой распространенностью заболевания в мире (не менее 3% населения земного шара подвержены заболеванию), и тем фактом, что оно чаще встречается у лиц трудоспособного возраста 40–50 лет. По данным российских и зарубежных авторов, количество больных уролитиазом в мире колеблется от 4 до 10%, а показатель рецидивирования заболевания достигает 50% [1, 2]. В структуре урологического стационара данная нозология встречается у 40% пациентов, из которых до 70% больных доставляют в стационар в экстренном порядке [1–6].

Комплексная терапия уролитиаза зачастую начинается с консервативного лечения, направленного на устранение причины заболевания. Наиболее эффективной бывает терапия у пациентов, причиной заболевания у которых могут быть нарушения в питании. Напротив, менее эффективна терапия при наличии у пациентов аномалий мочевых путей, а также при рецидивирующих и запущенных формах заболевания. Патогенетическая терапия уролитиаза включает в себя проведение противовоспалительной, антиоксидантной, метаболической терапии и улучшение микроциркуляции в сосудистом русле органа. Однако радикальное лечение уролитиаза чаще всего возможно при использовании оперативных методов [7, 8].

В РФ ежегодно проводится примерно 200 тысяч операций у пациентов с уролитиазом, между тем в 18% случаев это высокотехнологичная медицинская помощь. Несмотря на усовершенствование методов и технологий хирургического лечения уролитиаза в современном мире, количество послеоперационных осложнений в структуре заболевания по-прежнему остаётся значимым, и по данным литературы, в зависимости от способа оперативного вмешательства и подходов к оценке тяжести осложнений, составляет от 10 до 25% [9, 10].

Течение осложненного послеоперационного периода при уролитиазе находит отражение в изменениях состояния эндотелия сосудистой стенки, обусловлен данный процесс дисрегуляцией систем поддерживающих гомеостаз. Следовательно, активированные эндотелиальные клетки продуцируют цитокины, активные формы кислорода, метаболиты арахидоновой кислоты, факторы активации тромбоцитов, оксид азота, эндотелин и другие биологически активные соединения, определяющие процессы воспаления и регенерации. Наличие обширной эндокринной активности у эндотелия позволило дать ему название «эндокринное дерево» [11, 12].

Эндотелиальная недостаточность определяется дисбалансом между продукцией вазодилатирующих, ангио-протективных, антипролиферативных факторов с одной стороны и вазоконстриктивных, протромбических, про- лиферативных факторов с другой стороны. В оценке дисфункции эндотелия между тем особое внимание следует уделить изучению данных маркеров: феномен блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов, наличие мембран высвобожденных микрочастиц в периферической крови и экспрессии клетками крови и эндотелиоцитами различных рецепторов [13–15].

Целью явилось изучение механизма формирования эндотелиальной дисфункции при осложненном течении послеоперационного периода у пациентов с уролитиазом.

Материалы и методы

В исследование вошли 90 пациентов с мочекаменной болезнью, у которых были проведены оперативные вмешательства в отделении урологии Клинической больницы «РЖД-Медицина» г. Красноярска в период с 2017 по 2019 гг. Возраст пациентов, страдающих мочекаменной болезнью, в нашем исследовании составлял от 19 до 82 лет, при этом медиана по возрасту составила 54 года [37, 69].

Диагноз был выставлен с помощью клинико-инструментальных данных. Дистанционная литотрипсия (ДЛТ) была выполнена 21 пациенту, что составило 23,3%, также проводилась перкутанная нефролитолапаксия у 20 пациентов (22,2%), перкутанная мини-нефролитолапаксия была выполнена 32 больным (35,5%), уретероскопия, контактная литотрипсия была произведена 17 пациентам (19,0%). Консервативная терапия назначалась с учетом особенностей течения послеоперационного периода и согласно клиническим рекомендациям по лечению мочекаменной болезни.

Пациенты были разделены на три клинические группы: I группа (30 пациентов) с неосложненным течением послеоперационного периода, II группа (30 пациентов) послеоперационный период у которых осложнился развитием осложнений геморрагического характера, III группа (30 пациентов) послеоперационный период у которых осложнился развитием осложнений воспалительного характера.

Забор крови для оценки количества лимфоцитов и числа циркулирующих микрочастиц выполняли в до- и послеоперационном периоде. Оценку проводили в НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ. Лимфоциты и микрочастицы выделяли по стандартному способу: центрифугированием гепаринизирoванной крови по градиенту плотности с внедрением среды Lympholyte H CL5010 изготовления «Cedarlane Laboratories Limited» (Канада), переносили на предметное стеклышко, накрывали покровным стеклом и незамедлительно микроскопировали. Подсчет проводили с использованием фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Olympus BX–41 (Olympus, Япония)) (рис. 1, 2, 3).

Рис. 1. Интактный лимфоцит периферической крови (слева — фазово-контрастная микроскопия на флуоресцентном микроскопе, оптическое увеличение х80, в центре и справа — конфокальная микроскопия с использованием красителя ядер клеток DAPI и фазово-контрастная микроскопия, оптическое увеличение х60).

Рис. 2. Лимфоцит периферической крови в состоянии начального блеббинга (слева — фазово-контрастная микроскопия на флуоресцентном микроскопе, оптическое увеличение х80, в центре и справа — конфокальная микроскопия с использованием красителя ядер клеток DAPI и фазово-контрастная микроскопия, оптическое увеличение х60).

Рис. 4. Лимфоцит периферической крови в состоянии терминального блеббинга (слева — фазово-контрастная микроскопия на флуоресцентном микроскопе, оптическое увеличение х80, в центре и справа — конфокальная микроскопия с использованием красителя ядер клеток DAPI и фазово-контрастная микроскопия, оптическое увеличение х60).

Фенотипирование лимфоцитов проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью мышиных моно- клональных антител к молекулам различных CD-рецепторов лимфоцитов.

Полученные данные обработаны статистически. Характер распределения исследуемых величин оценивали на основании теста Шапиро-Уилкса. Исследуемые величины не соответствовали нормальному распределению. При характере распределения, отличном от нормального, описательная статистика представлена в виде медианы (Ме), 25 и 75 процентилей. Для выявления достоверных различий в группах применяли методы непараметрической статистики — критерии Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотезы принимали равным 0,05. Статистический анализ данных проведен с помощью пакета анализа Ms Excel 10.0, программы Statistica for Windows 6.0., и программы SPSS Statistics V. 17.0. Результаты статистической обработки сведены в таблицы.

Результаты и обсуждение

Анализируя показатели численности блеббингирующих лимфоцитов в начальной стадии, было зафиксировано статистически незначимое увеличение показателя в клинических группах II и III до 6,13 [4,35; 7,67] и 5,97 [4,45; 6,94] соответственно, между тем в I клинической группе показатель соответствовал средним значениям группы контроля (5,27 [3,81; 7,23]). Известно, что в развитии эндотелиальной недостаточности важное значение имеет показатель терминального блеббинга, который характеризует необратимый процесс в клетке. У пациентов клинической группы I показатель был в пределах средних значений группы контроля и составил 2,67 [1,70; 4,08]. Однако в клинических группах II и III отмечалось значимое увеличение показателя терминального блеббинга (16,09 [13,87; 19,21]) и 9,45 [7,21; 12,34]. Следовательно, данная тенденция сохранялась при анализе данных суммарного блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов.

Количество свободных микрочастиц лимфоцитарного происхождения в периферической крови пациентов было статистически увеличено в клинической группе III и составляло 631 [423; 827]. Однако в I и II клинических группах уровень показателя не отличался от данных контрольной группы. Необходимо отметить наличие прямой зависимости уровня лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга от наличия свободных микрочастиц лимфоцитарного происхождения.

При оценке уровеня экспрессии лимфоцитами CD 38 было установлено, что в I группе показатели достоверно не отличались от группы контроля (14,24 [11,32; 16,54]). Между тем, во II группе было зарегистрировано статистически значимое увеличение экспрессии лимфоцитами CD 38 (19,94 [17,35; 22,37]), а в III группе — 17,30 [15,45; 19,20]. Однако экспрессия лимфоцитами CD 31 была увеличена во всех клинических группах и составила 17,89 [15,35; 21,02], 35,08 [29,21; 41,40] и 25,50 [22,14; 28,31] соответственно (Таблица 1).

Таблица 1

Показатели эндотелиальной недостаточности у пациентов с уролитиазом в предоперационном периоде

Показатели Контрольная группа Группа I Группа II Группа III Лимфоциты в состоянии начального блеббинга, % 5,22 [3,45; 6,29] 5,27 [3,81; 7,23] p¹=0,543 6,13 [4,35; 7,67] p¹=0,056 p²=0,067 5,97 [4,45;6,94] p¹ =0,068 p²=0,072 Лимфоциты в состоянии терминального блеббинга, % 3,39 [1,72; 4,44] 2,67 [1,70; 4,08] p¹=0,612 16,09 [13,87; 19,21] p¹<0,001 p²<0,001 9,45 [7,21; 12,34] p¹ <0,001 p²<0,001 Суммарный блеббинг лимфоцитов в пересчете на 100 клеток 9,25 [6,10; 11,31] 8,25 [6,32; 10,50] p¹=0,512 21,03 [18,34; 25,65] p¹<0,001 p²<0,001 21,56 [18,66; 28,28] p¹ <0,001 p²<0,001 Циркулирующие мембран-высво-божденные микрочастицы, % 386 [200; 453] 423 [213; 568] p¹=0,432 435 [367; 541] p¹=0,089 p²=0,058 631 [423; 827] p¹ =0,023 p²=0,034 CD 38 – экспрессирующие лимфоциты, % 12,40 [8,82; 15,07] 14,24 [11,32; 16,54] p¹=0,467 19,94 [17,35; 22,37] p¹<0,001 p²<0,001 17,30 [15,45; 19,20] p¹ <0,001 p²=0,028 CD 31 – экспрессирующие лимфоциты, % 8,14 [6,03; 10,22] 17,89 [15,35; 21,02] p¹<0,001 35,08 [29,21; 41,40] p¹<0,001 p²<0,001 25,50 [22,14; 28,31] p¹ <0,001 p²<0,001 р1 — достоверность различия между показателями контроля и исследуемой группой; р2 — достоверность различия между показателями группы I и групп II, III.

В клинических группах численность лимфоцитов в состоянии начального блеббинга была увеличена (7,61 [4,79; 10,59], 9,26 [8,95; 11,54] и 15,92 [13,20; 17,01] соответственно). Показатель блеббингирующих лимфоцитов в терминальном состоянии был увеличен во всех трех клинических группах (8,55 [6,98; 12,04], 19,17 [12,95; 22,43] и 21,93 [17,67; 30,45] соответственно). В соответствии с этим показатель суммарного блеббинга возрос во всех клинических группах. При регистрации показателя присутствия циркулирующих микрочастиц наибольшее количество было зафиксировано у пациентов клинической группы II, 1050 [826; 1558]. Впрочем, статистически значимое увеличение показателя было также зарегистрировано в клинических группах I и III 796 [663; 852] и 835 [623; 1069] соответственно.

При анализе данных, полученных в послеоперационном периоде, было выявлено статистически значимое повышение экспрессии лимфоцитами CD 38, доминирующее в клинических группах II и III (26,14 [19,66; 31,60] и 25,09 [21,95; 28,34] соответственно). Аналогичная тенденция отмечалась при экспрессии лимфоцитами CD 31, со статистически значимым возрастанием показателя в клинических группах II и III (43,29 [31,18; 52,80] и 34,58 [31,21; 37,48] соответственно).

Это может указывать на развитие эндотелиальной недостаточности у пациентов с развитием осложнений в послеоперационном периоде. Впрочем, механизмы становления данного состояния различны. CD 31 принимает участие в адгезии лимфоцитов к сосудистой стенке, приводя к локализованному асептическому воспалению сосудистой стенки. CD 38 активирует лимфоциты, усиливая продукцию цитокинов, и запускает серию апоптических процессов в эндотелиоците (Таблица 2).

Таблица 2

Показатели эндотелиальной недостаточности у пациентов с уролитиазом в послеоперационном периоде

Показатели Контрольная группа Группа I Группа II Группа III Лимфоциты в состоянии начального блеббинга, % 5,22 [3,45; 6,29] 7,61 [4,79; 10,59] p¹=0,536 9,26 [8,95; 11,54] p¹<0,001 p²=0,057 15,92 [13,20; 17,01] p¹ <0,001 p²=0,079 Лимфоциты в состоянии терминального блеббинга, % 3,39 [1,72; 4,44] 8,55 [6,98; 12,04] p¹<0,001 19,17 [12,95; 22,43] p¹<0,001 p²<0,001 21,93 [17,67; 30,45] p¹ <0,001 p²<0,001 Суммарный блеббинг лимфоцитов, % 9,25 [6,10; 11,31] 16,23 [11,84; 22,91] p¹=0,117 28,24 [20,30; 34,98] p¹<0,001 p²=0,042 38,12 [31,07; 46,55] p¹ <0,001 p²<0,001 Циркулирующие мембран-вы-свобожденные микрочастицы, % 386 [200; 453] 796 [663; 852] p¹<0,001 1050 [826; 1558] p¹<0,001 p²<0,001 835 [623; 1069] p¹ <0,001 p²=0,052 CD 38 – экспрессирующие лимфоциты, % 12,40 [8,82; 15,07] 16,28 [9,28; 19,15] p¹=0,654 26,14 [19,66; 31,60] p¹<0,001 p²<0,001 25,09 [21,95; 28,34] p¹ <0,001 p²<0,001 CD 31 – экспрессирующие лимфоциты, % 8,14 [6,03; 10,22] 26,31 [21,34; 30,68] p¹<0,001 43,29 [31,18; 52,80] p¹<0,001 p²<0,001 34,58 [31,21; 37,48] p¹ <0,001 p²<0,001 р1—достоверность различия между показателями контроля и исследуемой группой; р2 — достоверность различия между показателями групп 2.1 и 2.2.

Парадокс возникновения блеббинга плазматической мембраны клеток, а также образование свободных микрочастиц лимфоцитарного происхождения состоит в том, что они принимают участие в патогенезе развития эндотелиальной недо- статочности [10]. Следовательно, блеббинг плазматической мембраны возможно считается пусковым механизмом активации эндотелиальной недостаточности, а свободные микрочастицы, имеющие активизированные рецепторы по отношению к эндотелиальным клеткам, оказывают значимое влияние на тяжесть данного состояния.

Таким образом, изучая факторы, формирующие эндотелиальную недостаточность у пациентов с осложненным течением послеоперационного периода при мочекаменной болезни, можно предположить, что они являются пусковыми точками развития данного состояния. В дальнейшем воздействие на данные факторы возможно позволит не только прогнозировать развитие осложнений, но и профилактировать его.

В данном исследовании выявлено, что при развитии послеоперационных осложнений определяется большое количество лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга, а также увеличивается показатель наличия циркулирующих микрочастиц лимфоцитарного происхождения. Регистрируется повышение экспрессии лимфоцитами CD 38 и CD 31. Таким образом, блеббинг как начальная форма апоптоза является чувствительным маркером развития эндотелиальной дисфункции. Показатели начального и терминального блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов можно рассматривать как предикторы осложненного течения послеоперационного периода при уролитиазе.

Заключение:

У пациентов с уролитиазом в послеоперационном периоде развивается эндотелиальная недостаточность. Однако при развитии послеоперационных осложнений воспалительного или геморрагического характера механизм и выраженность межклеточной коммуникации в патогенезе формирования дисфункции эндотелия существенно отличается, что необходимо учитывать при проведении оперативного пособия и назначения патогенетической и симптоматической терапии в раннем послеоперационном периоде.