Функциональное состояние нейтрофилов морских свинок, иммунизированных экспериментальными конъюгатами после сенсибилизации Mycobacterium smegmatis

Введение. Род Mycobacterium , помимо наиболее известных строгих внутриклеточных патогенов человека и животных – M. tuberculosis и M. bovis , также представлен облигатными и условно-патогенными микобактериями, объединенными в группу нетуберкулезных микобактерий (НТМ), имеющую широкое распространение в окружающей среде (воде, почве, пыли и т. д.) и способную вызывать инфекции у людей и других млекопитающих [1, 2].

В микробиоте животных можно выявить несколько видов НТМ, относящихся к группе быстрорастущих, которые вызывают развитие заболевания на фоне нарушения иммунных функций организма [3]. Несмотря на то, что заражение животных НТМ, как правило, не ассоциируется с проявлением клинических признаков, некоторыми учеными было описано наличие гранулематозных поражений. В частности M. fortuitum вызывает патологию такого рода в коже, легких, лимфатических узлах и суставах, являясь преобладающим видом, выделенным у крупного рогатого скота из туберкулезоподобных поражений [4–6], M. smegmatis – в тканях молочной железы крупного рогатого скота [7], а M. phlei – в лимфатических узлах в виде пиогранулема-тозной реакции [8].

Многочисленные данные также свидетельствуют, что быстрорастущие микобактерии чаще других видов вызывают перекрестные реакции у не больного туберкулезом скота при диагностическом тестировании с помощью наиболее распространенного метода – внутрикожной туберкулиновой пробы. В частности на территории России ветеринарными лабораториями НТМ этого типа выделены в 59,5 % случаев от крупного рогатого скота, имеющего неспецифические реакции на введение аллергена [9]. Аналогичные данные получены учеными Сибирского региона [10], Республики Дагестан [11, 12], которыми установлено доминирование M. phlei , M. smegmatis и M. fortuitum в общей структуре изолированных культур.

Отмечается, что быстрорастущие штаммы НТМ, выделенные от домашних и диких животных, в определенной степени устойчивы к большинству антибиотиков, рекомендованных для лечения людей, а инфекции, вызванные этим типом микобактерий, очень трудно поддаются лечению и часто рецидивируют [13, 14]. Все это указывает на необходимость разработки эффективных вакцин и лекарственных препаратов.

В настоящее время, несмотря на широкое распространение НТМ, вакцины против этих микроорганизмов отсутствуют. Однако для разработки иммунобиологических препаратов для лечения или профилактики микобактериозов можно внедрить те же самые стратегии, которые рассматриваются в отношении патогенных микобактерий [15].

К неоднозначному утверждению приходят разные исследователи, обращавшиеся к вопросу использования с этой целью бациллы Кальметта-Герена. Одни отмечают потенциал вакцины БЦЖ в плане перекрестно-защитного профилактического и иммунотерапевтического эффекта против некоторых значимых видов НТМ [16, 17], другие, напротив, указывают на отсутствие и даже снижение эффективности в случае ее введения сенсибилизированным животным [18, 19]. Вместе с этим отмечается, что негативное влияние микобактерий окружающей среды на последующую иммунизацию отсутствовало в тех случаях, когда применяли инактивированные противотуберкулезные препараты [20].

Ранее были сконструированы специфические иммуномодуляторы, полученные из культуры вакцинного штамма БЦЖ, разрушенной ультразвуком, а затем конъюгированной с бетулином и его производными: бетулиновой и бе-тулоновой кислотой. Экспериментальные конъюгаты продемонстрировали выраженную защитную эффективность против возбудителя бычьего туберкулеза [21], а также способствовали ускоренному выведению микобактерий из организма морских свинок, сенсибилизированных Mycobacterium scrofulaceum (2-й группы по Раньону), за счет стимуляции иммунной функции нейтрофильных гранулоцитов [22].

Цель исследования – оценить функциональное состояние аэробных и анаэробных бактерицидных систем нейтрофилов у морских свинок, обработанных экспериментальными конъюгатами антигенов БЦЖ с бетулиновой и бетулоновой кислотой после инфицирования быстрорастущими микобактериями (4-й группы по Раньону).

Объекты и методы. Объектом исследования являлись морские свинки, подобранные по принципу аналогов (масса – 0,4–0,5 кг, возраст – 4– 5 мес.). Экспериментальная работа с животными осуществлялась согласно требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. и одобрена локальным независимым этическим комитетом ФГБНУ «Омский АНЦ» по уходу и использованию лабораторных животных.

Для заражения использовали 14–21-суточную культуру из Биоресурсной коллекции патогенных микроорганизмов Mycobacterium smegmatis (быстрорастущие микобактерии, 4-я группа по классификации Раньона), которую инокулировали подкожно в область паха слева в дозе 5 мг/мл.

Получение антигенных комплексов из выращенного на жидкой питательной среде вакцинного штамма БЦЖ, а также их последующую конъюгацию с бетулиновой и бетулоновой кислоты осуществляли по методике, описанной в работе [23]. Синтез производных бетулина проведен на кафедре органической и экологической химии Института химии ФГАОУ ВО «Тюменский государственный университет» профессором, доктором химических наук И.В. Кулаковым.

Для эксперимента было отобрано 20 морских свинок, разделенных на 4 группы по 5 голов в каждой. Животным 1–3-й группы была инокулирована культура M. smegmatis , затем через 14 сут особям 2-й группы был введен конъюгат антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой подкожно в область паха справа в дозе 0,5 мл и 3-й группы – конъюгат антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой по той же схеме. Еще 5 интактных морских свинок служили в качестве контроля.

Отбор проб крови производили из ретроор-битального венозного сплетения с помощью микропипетки на 14-е, 28- и 42-е сут после введения Mycobacterium smegmatis для оценки состояния аэробных (миелопероксидаза) и анаэробных (катионные белки) бактерицидных систем нейтрофилов, а также выявления антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в соответствии с методическими рекомендациями [24].

Для математической обработки цифрового материала были применены стандартные методы вариационной статистики, которые включали определение средней арифметической (M) и ошибки средней арифметической (m ±). Межгрупповые сравнения осуществлялись с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с постхоками Тьюки. Оценку достоверности различий (р) между средними величинами контрольной и опытной групп проводили с по- мощью t-критерия Стьюдента и критерия Тьюки и при уровне значимости р ≤ 0,05 их считали статистически достоверными.

Результаты и их обсуждение . Цитохимические параметры у интактных морских свинок характеризовались наличием (21,80 ± 1,62) % нейтрофилов с высокой насыщенностью гранул цитоплазмы миелопероксидазой; (10,80 ± 2,58) % -со средней и (9,00 ± 1,18) % фагоцитов с низкой плотностью гранул (табл. 1). Аналогичные показатели, классифицирующие фагоциты по содержанию катионных белков, составили (30,60 ± 3,23) %, (13,20 ± 2,59) и (7,80 ± 2,82) % соответственно. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) катионных белков был несколько выше, чем СЦК миелопероксидазы (соответственно (1,26 ± 0,06) и (0,96 ± 0,09) у.е.) за счет большей численности клеток с высокой и средней плотностью гранул.

Инфицирование морских свинок НТМ сопровождалось усилением деятельности антимикробных компонентов нейтрофилов к 14-м сут от начала эксперимента, на это указывало достоверное повышение во всех опытных группах числа нейтрофилов с высокой насыщенностью гранул миелопероксидазой, а также катионными белками. Так, в 1-й опытной группе количество таких клеток с миелопероксидазой и катионными белками относительно контроля возрастало соответственно в 1,79 и 1,5 раза, во 2-й - в 1,86 и 1,59 раза и 3-й - в 1,71 и 1,7 раза.

Вследствие этих изменений также происходило увеличение СЦК миелопероксидазы в среднем в 1,58-1,62 раза (р < 0,01) в 1-3-й группах относительно контрольной группы, а также СЦК катионных белков - в 1,58-1,62 раза (р < 0,05) в группах инфицированных животных по сравнению с интактными.

Таблица 1

Ферментная активность миелопероксидазы и содержание катионных белков нейтрофилов у морских свинок на 14-е сут после сенсибилизации НТМ, M±m Myeloperoxidase enzyme activity and cationic protein content of neutrophils in guinea pigs on the 14th day after sensitization with NTM, M±m

Группа животных	Насыщенность цитоплазмы гранулами, %			СЦК, у.е.
	высокая	средняя	низкая
Миелопероксидаза
Контрольная	21,80 ± 1,62	10,80 ± 2,58	9,00 ± 1,18	0,96 ± 0,09
1-я опытная	39,00 ± 3,14**A	15,20 ± 2,39	8,60 ± 2,09	1,56 ± 0,08**A
2-я опытная	40,60 ± 2,66***A	12,20 ± 1,28	6,40 ± 1,36	1,52 ± 0,10**A
3-я опытная	37,40 ± 3,81**A	15,20 ± 1,02	12,40 ± 1,50	1,55 ± 0,11** A
Катионные белки
Контрольная	30,60 ± 3,23	13,20 ± 2,59	7,80 ± 2,82	1,26 ± 0,06
1-я опытная	46,00 ± 5,83*	19,80 ± 2,20	9,60 ± 2,31	1,87 ± 0,16**A
2-я опытная	48,60 ± 5,91*	17,20 ± 3,26	12,60 ± 3,03	1,93 ± 0,11**A
3-я опытная	52,00 ± 7,05*	11,80 ± 2,44	5,20 ± 0,37	1,85 ± 0,18*A

Примечание: *различия относительно контрольной группы достоверны на уровне р < 0,05, ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 по t-критерию Стьюдента; A - достоверность к значениям контрольной группы (р 1 < 0,05) по критерию Тьюки.

Однофакторный дисперсионный анализ параметров функционального состояния нейтрофилов у морских свинок на 14-е сут после инфицирования НТМ указывал на неоднородность между группами средних величин фагоцитов, имеющих высокую насыщенность цитоплазмы гранулами миелопероксидазой (р < 0,01), а также СЦК миелопероксидазы (р < 0,001) и СЦК катионных белков (р < 0,01). В частности значения высокоактивных клеток с миелопероксидазой были выше на 71-86 % (р1 < 0,01), СЦК миелоперокси дазы - на 58-62,5 % (р1 < 0,01), СЦК катионных белков - на 47-53 % (р1 < 0,05) во всех опытных группах по сравнению с интактными животными.

При постановке РНИФ в мазках крови у 100 % морских свинок 1-3-й групп на 14-е сут после инокуляции M. smegmatis был обнаружен мико-бактериозный антиген с помощью гомологичных сывороток, полученных от зараженных животных, тогда как у всех интактных особей реакция была отрицательной.

К 28-м сутк после инокуляции НТМ (1-я группа) активность антимикробных компонентов нейтрофилов сохранялась на более высоком уровне по сравнению с контрольной группой (табл. 2). В частности увеличивалось число высокоактивных клеток с миелопероксидазой и катионными белками соответственно в 1,33 (р <  0,05) и 1,44 раза (р <  0,01) относительно интактных морских свинок. Также в этой группе наблюдалось достоверное повышение СЦК соответственно в 1,21 и 1,3 раза.

В случае введения через 14 сут после инфицирования НТМ экспериментального конъюгата с бетулоновой кислотой (3-я группа) также наблюдали усиление функционального состояния ней- трофилов. Это происходило за счет увеличения численности клеток с высокой насыщенностью гранул миелопероксидазой и катионными белками соответственно в 1,33 (р < 0,01) и 1,39 раза (р < 0,05) относительно контрольной группы. Повышению также подверглись СЦК миелопероксидазы в 1,25 раза (р < 0,01) и СЦК катионных белков в 1,36 раза (р < 0,05).

При введении конъюгата с бетулиновой кислотой (2-я группа) наблюдалось только усиление деятельности катионных белков, где также относительно группы интактных морских свинок увеличивался процент нейтрофилов с высокой активностью гранул в 1,42 раза (р < 0,05), а также СЦК в 1,45 раза (р < 0,01).

Таблица 2

Ферментная активность миелопероксидазы и содержание катионных белков нейтрофилов у морских свинок на 28-е сут после сенсибилизации НТМ

(14-е сут после введения конъюгата), M±m

Myeloperoxidase enzyme activity and cationic protein content of neutrophils in guinea pigs on the 28th day after sensitization with NTM (14th day after administration of the conjugate), M±m

Группа животных	Насыщенность цитоплазмы гранулами, %			СЦК, у.е.
	высокая	средняя	низкая
Миелопероксидаза
Контрольная	23,20 ± 1,98	12,80 ± 1,16	8,60 ± 0,98	1,04 ± 0,04
1-я опытная	31,00 ± 1,67*A	13,00 ± 1,26	7,60 ± 1,33	1,26 ± 0,06*A
2-я опытная	25,60 ± 2,34	13,60 ± 0,98	12,00 ± 1,30	1,16 ± 0,07
3-я опытная	31,00 ± 1,09**A	15,40 ± 0,60	6,20 ± 1,39C	1,30 ± 0,03**A
Катионные белки
Контрольная	28,60 ± 1,36	13,00 ± 2,47	7,40 ± 2,64	1,19 ± 0,06
1-я опытная	41,20 ± 1,83**	12,00 ± 1,70	7,80 ± 3,35	1,55 ± 0,10*
2-я опытная	40,60 ± 3,99*	15,40 ± 1,72	16,40 ± 2,99	1,69 ± 0,08**A
3-я опытная	39,80 ± 4,61*	18,00 ± 3,29	6,40 ± 1,96	1,62 ± 0,16*

Примечание: ^различия относительно контрольной группы достоверны на уровне р < 0,05;

Сравнение межгрупповых значений с помощью дисперсионного анализа через 28 сут после инфицирования НТМ (14 суток после введения экспериментальных конъюгатов) морских свинок выявило неоднородность в содержании клеток с высокой насыщенностью цитоплазмы гранулами с миелопероксидазой и катионными белками и их СЦК (р < 0,05), а также с низкой плотностью гранул с миелопероксидазой (р < 0,05). Так, относительно контрольной группы повышалось число клеток с высокой ферментной активностью на 32,5 % (р1 < 0,05) у инфицированных животных, не подвергнутых обработке препаратом (1-я группа), а также иммунизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой (3-я группа). Также в этих же группах были выше значения СЦК на 21 и 25 % соответственно (р1 < 0,05). Что касается катионных белков, то относительно контроля отмечен только значимый рост СЦК у особей, обработанных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой (2-я группа) на 42 % (р1 < 0,05). Помимо этого относительно 2-й группы обнаружено снижение числа фагоцитов с низкой насыщенностью цитоплазмы гранулами с миелопероксидазой на 48,5 % (р3 < 0,05).

Серологическими исследованиями был зафиксирован положительный результат в 100 % случаев только в группе животных, инфициро- ванных M. smegmatis без последующей обработки экспериментальным препаратом (1-я группа).

На 42-е сут после сенсибилизации НТМ (табл. 3) происходило снижение анаэробного метаболизма нейтрофилов у животных, не подвергнутых обработке препаратом (1-я группа), о чем свидетельствовало восстановление активности катионных белков до значений, характер-

Таблица 3

Ферментная активность миелопероксидазы и содержание катионных белков нейтрофилов у морских свинок на 42-е сут после сенсибилизации НТМ

(28-е сут после введения конъюгата), M±m

Myeloperoxidase enzyme activity and cationic protein content of neutrophils in guinea pigs on the 42th day after sensitization with NTM (28th day after administration of the conjugate), M±m

Группа животных	Насыщенность цитоплазмы гранулами, %			СЦК, у.е.
	высокая	средняя	низкая
Миелопероксидаза
Контрольная	24,80 ± 1,83	9,40 ± 1,57	9,00 ± 1,14	1,02 ± 0,04
1-я опытная	25,60 ± 1,80	14,40 ± 0,93*	13,60 ± 2,84	1,18 ± 0,03*
2-я опытная	34,60 ± 1,53**AB	11,40 ± 0,51	6,00 ± 0,31*	1,32 ± 0,04**A
3-я опытная	40,20 ± 2,35**AB	19,20 ± 2,06**AC	5,20 ± 1,71B	1,64 ± 0,05***ABC
Катионные белки
Контрольная	30,20 ± 3,06	10,20 ± 0,66	7,60 ± 1,91	1,18 ± 0,08
1-я опытная	33,40 ± 1,50	10,20 ± 2,06	5,80 ± 1,56	1,26 ± 0,06
2-я опытная	54,20 ± 1,20***AB	11,00 ± 1,67	7,80 ± 1,91	1,92 ± 0,03***AB
3-я опытная	58,40 ± 2,75***AB	6,20 ± 1,50*	6,80 ± 1,39	1,94 ± 0,06***AB

Примечание: *различия относительно контрольной группы достоверны на уровне р<0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 по t-критерию Стьюдента; A – достоверность к значениям контрольной группы (р 1 < 0,05); B – к значениям 1-й опытной группы (р 2 < 0,05); C – к значениям 2-й опытной группы (р 3 < 0,05) по критерию Тьюки.

По сравнению с предыдущими сроками исследования ферментная активность миелопероксидазы к 42-м сут существенно снижалась, но, тем не менее, по-прежнему была достоверно повышена в 1,53 раза (р < 0,05) относительно контрольной группы за счет нейтрофилов со средней насыщенностью цитоплазмы гранулами. Помимо этого уровень СЦК также был более высоким и в среднем был выше на 1,15 раза (р < 0,05) относительно интактных животных.

У особей, подвергнутых введению конъюгата антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой (2-я группа), также как и препарата с бетулоно-вой кислотой (3-я группа), отмечена гиперреактивность антимикробных бактерицидных систем фагоцитов. Можно выделить увеличение числа высокоактивных клеток с миелопероксидазой во 2-й группе в 1,39 раза (р < 0,01) и в 3-й – в 1,62 раза (р < 0,01) по сравнению с интактными животными, а также с катионными белками соответственно в 1,79 (р < 0,001) и 1,93 раза ных для интактных морских свинок. Так, количество клеток с высокой плотностью гранул находилось приблизительно на одном уровне ((33,40 ± 1,50) %, (30,20 ± 3,06) %), а со средней насыщенностью – было идентичным ((10,20 ± 2,06) %, (10,20 ± 0,66) %). СЦК также не имел статистически достоверной разницы.

(р < 0,001) относительно контрольной группы. Вследствие этих изменений также был увеличен среднегрупповой уровень СЦК миелопероксидазы в 1,29 (р < 0,01) и 1,60 раза (р < 0,001) и катионных белков в 1,63 (р < 0,001) и 1,64 раза (р < 0,001).

Дисперсионный анализ выявил неоднородность всех без исключения параметров ферментной активности миелопероксидазы (р < 0,05 и ниже), а также содержания клеток в высокой насыщенностью цитоплазмы гранулами с катионными белками и их СЦК (р < 0,001). Относительно контрольной группы число клеток с высокой активностью миелопероксидазы и катионных белков были выше на 39,5 (р1 < 0,05) и 79,5 % (р1 < 0,001) соответственно во 2-й группе, на 62 (р1 < 0,001) и 93 % (р1 < 0,001) – в 3-й группе, а их уровни СЦК возрастали на 29,5 (р1 < 0,001) и 63 % (р1 < 0,001) во 2-й группе, на 61 (р1 < 0,001) и 64,5 % (р1 < 0,001) – в 3-й группе. Также увеличивалось количество нейтрофи- лов со средней насыщенностью цитоплазмы гранулами миелопероксидазы у иммунизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоно-вой кислотой (3-я группа) на 103,5 % (р1 < 0,001) по сравнению с интактными особями и на 68,5 % (р3 < 0,01) по сравнению с животными, обработанными конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой (2-я группа).

Число высокоактивных фагоцитов с миелопероксидазой и катионными белками также было выше соответственно на 35 (р 2 < 0,05) и 62 % (р 2 < 0,001) во 2-й группе и на 57 (р 2 < 0,001) и 75 % (р 2 < 0,001) по сравнению с 1-й группой. Также увеличивался уровень СЦК катионных белков на 52,5 (р 2 < 0,001) во 2-й группе и на 54 % (р 2 < 0,001) в 3-й группе, тогда как СЦК миелопероксидазы возрастал на 39 % (р 2 < 0,001) только в 3-й группе. Кроме этого достоверная разница установлена между величинами СЦК катионных белков 2-й и 3-й группы (р 3 < 0,001).

По результатам исследований мазков крови в РНИФ на 42-е сут после инокуляции быстрорастущих микобактерий антиген-антительные комплексы были обнаружены у 60 % морских свинок, инфицированных M. smegmatis без последующей обработки экспериментальными конъюгатами.

Обобщая полученные результаты, необходимо отметить, что нейтрофилы, по-видимому, играют определяющую роль в защите организма морских свинок от Mycobacterium smegmatis, о чем свидетельствует выраженная активизация кислороднезависимой (катионные белки) и кис-лородзависимой (миелопероксидаза) бактерицидных систем на 14-е сут после их инокуляции. На это также указывают другие ученые, занимавшиеся изучением взаимодействия фагоцитов с этим микроорганизмом [25, 26].

При инфицировании морских свинок повышенная деятельность катионных белков прослеживалась до 28-х сут, а миелопероксидазы – сохранялась до 42-х сут, несмотря на снижение интенсивности по сравнению с более ранним периодом, что могло быть связано с неполной элиминацией микобактерий. Результаты серологических исследований подтверждали наличие антигена в крови в этот срок у 60 % животных. Аналогичные результаты были получены в другом эксперименте [27], в котором из нескольких видов НТМ только M. smegmatis проявлял устойчивость к фагоцитозу на 42-е сут после его инокуляции.

Введение экспериментальных конъюгатов оказывало стимулирующий эффект на деятельность внутриклеточных антимикробных компонентов нейтрофилов, способствуя ускоренной элиминации быстрорастущих микобактерий из организма животных через 14 сут после иммунизации, на что указывало отсутствие антигена в крови. Сходные результаты ранее нами были также получены при сенсибилизации морских свинок скотохромагенными микобактериями M. scrofulaceum [22]. Следует отметить, что антигенный комплекс, конъюгированный с бетулоно-вой кислотой, в отличие от аналогичного препарата с бетулиновой кислотой, индуцировал более выраженную активизацию ферментной активности миелопероксидазы.

Заключение . На основании полученных результатов можно прийти к заключению, что инфицирование морских свинок Mycobacterium smegmatis сопровождается усилением деятельности катионных белков нейтрофилов, наблюдаемом в течение 28 сут, и более продолжительной активизацией внутриклеточной миелопероксидазы – 42 сут. Введение экспериментальных препаратов стимулирует работу бактерицидных компонентов фагоцитов, способствуя элиминации быстрорастущих микобактерий в течение 14 сут. Конъюгат антигенов БЦЖ с бе-тулоновой кислотой индуцировал более выраженную активность миелопероксидазы.