Функциональный статус тромбоцитарного гемостаза у телят ярославской породы на протяжении фазы молочно-растительного питания

Кеуwords: calves, phase of milk and vegetable nutrition, Yaroslavl breed, platelets, aggregation, secretion

Первичный гемостаз является весьма значимым для поддержания постоянства внутрисосудистой среды в организме. Особо функционально важна для протекания процессов микроциркуляции активность тромбоцитов [5]. Ее выраженность во многом поддерживает оптимум микрореологии крови [2]. Замечено, что с возрастом и под влиянием многих внешних воздействий гемостатические свойства тромбоцитов могут меняться в широком диапазоне. Известно, что изменения активности тромбоцитов сопровождают перемены функционального статуса организма и формирование различных дисфункций. Вместе с тем, возрастные особенности функционирования тромбоцитов у крупного рогатого скота разных пород изучены слабо. Имеется недостаточно работ, посвященных активности тромбоцитов у телят и коров с учетом породной принадлежности [6]. По этой причине пока нет возможности составить целостную картину онтогенетической динамики функциональных свойств тромбоцитов у крупного рогатого скота [8]. В той связи необходимы дальнейшие работы, позволяющие широко рассмотреть их биологические аспекты у телят и коров. Данные исследования способны помочь проследить связь между активностью тромбоцитов и состоянием микроциркуляции, весьма значимой для роста и развитием животных, а, следовательно, для реализации их продуктивного потенциала [11]. Наличие межпородных различий у крупного рогатого скота по физиологическим и биохимическим параметрам дает серьезные основания полагать, что также существуют межпородные различия по активности тромбоцитов, участвующие в формировании различного уровня трофики тканей у животных разных пород. Есть основания предполагать, что эти различия могут вносить определенный вклад в межпородную разницу по уровню продуктивности. В этой связи вызывает особый интерес оценка активности тромбоцитов у молодняка высокопродуктивных пород в течение раннего онтогенеза.

Цель – проследить динамику активности тромбоцитов у телят молочнорастительного питания ярославской породы.

Материал и методы исследований. Исследования проводились в строгом соответствии с этическими принципами, установленными Европейским комитетом по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (принят в Страсбурге 18 марта 1986 года и подтвержден в Страсбурге 15 июня 2006 года) и утвержденными местным этическим комитетом Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания животных – филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста (протокол №4 от 04 апреля 2017 года).

Статья выполнена на материалах обследования 42 телят чистокровных по ярославской породе. Их получили после 23 стельности от здоровых коров. Все телята были обследованы пятикратно: на 31, 45, 60, 75 и 90 сутки жизни.

Оценивали уровень синтеза тромбоксана в тромбоцитах и активность тромбоцитарных циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы по результатам проведения трех проб переноса в ходе регистрации агрегации тромбоцитов на фотоэлектроколориметре [3]. В тромбоцитах животных выясняли количество аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата. Оценивали способность тромбоцитов к их секреции под действием коллагена. В тромбоцитах определяли концентрацию актина и миозина при базальном состоянии и в активированном состоянии под действием на них аденозиндифосфата [3].

Агрегацию тромбоцитов (АТ) оценивали по времени развития этого процесса, используя визуальный микрометод [12]. Как индукторы тромбоцитарной агрегации в исследовании использовали аденозиндифосфат (0,5 х 10-4 М), адреналин (5,0x10-6 М), коллаген (разведение 1:2 основной суспензии), тромбин (0,125 ед/мл) и ристомицин (0,8 мг/мл). Оценка АТ велась в плазме, стандартизованной по количеству в ней тромбоцитов до уровня 200x109 тромбоцитов в литре. Состояние внутрисосудистой активности тромбоцитов определяли путем фазово-контрастной микроскопии [12]. Статистическая обработка полученной информации производилась с помощью пакета программ «статистика для Windows v. 6.0», «Microsoft Excel». Различия в данных считались достоверными в случае Р<0,05.

Результат исследований.

Количество активных тромбоцитов-дискоцитов в крови животных к возрасту 45 суток уменьшалось на 15 %, в последующем, постепенно повышаясь и достигая к 90 суткам уровня 68,8±0,17 %. Суммарное количество активных тромбоцитов у них к 45 суткам возрастало на 27,9 %, а затем быстро приходило к уровню исхода. Число мелких и более крупных агрегатов тромбоцитов в этом возрасте увеличивалось на 27,9 % и 59,1 %, соответственно, затем понижаясь к концу фазы до уровня, имевшего место в ее начале (Таблица 1).

Таблица 1 – Внутрисосудистая активность тромбоцитов у телят ярославской породы молочнорастительного питания

Показатель	Возраст телят ярославской породы, n=42, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Уровень тромбоцитов-дискоцитов, %	68,1±0,19	59,2±0,28 Р<0,01	61,3±0,14 Р<0,05	62,8±0,18 Р<0,05	68,8±0,17 Р<0,05
Сумма активированных форм тромбоцитов, %	31,9±0,14	40,8±0,25 Р<0,01	38,7±0,16 Р<0,01	37,2±0,19 Р<0,05	31,2±0,14
Количество малых тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	6,1±0,08	7,8±0,17 Р<0,01	7,3±0,12 Р<0,01	6,8±0,14 Р<0,05	6,2±0,18
Количество средних и больших тромбоцитарных агрегатов, на 100 свободных тромбоцитов	0,22±0,019	0,35±0,029 Р<0,01	0,32±0,018 Р<0,01	0,28±0,015 Р<0,01	0,23±0,02 0

Примечание: Р – достоверность динамики показателей по отношению к 31 суточному возрасту. В последующих таблицах обозначения сходные.

У телят ярославской породы в возрасте 45 суток наступала пиковая активация тромбоцитов. В этом возрасте у телят ускорялась АТ с коллагеном на 49,4 %, затем она быстро тормозилась и выходила на исходный уровень к 90 суткам жизни. Также кратковременное ускорение АТ отмечалось с аденозиндифосфатом на 45,6 % и с ристомицином на 41,4 %. Аналогичное кратковременное ускорение АТ выявлено в ответ на тромбин и адреналин. Время развития агрегации с ними ускорялось к 45 суткам, а затем тормозилось до уровня исхода к 90 суткам жизни. Весьма важным механизмом наступления эпизода ускорения АТ у телят к 45 суточному возрасту можно считать кратковременное усиление синтеза тромбоцитарного тромбоксана. На это указывал рост на 30,3 % АТ в простой пробе переноса. Он реализовался за счет кратковременной активации в возрасте 45 суток тромбоцитарных циклооксигеназы на 19,0 % и тромбоксансинтетазы на 27,2 %. Об усилении активности этих ферментов говорило быстропроходящее усиление АТ в коллаген-аспириновой пробе до 98,7± 0,27 % и АТ в коллаген-имидазольной пробе до 61,2±0,23 %, которое сменялось их ослаблением к 90 суткам до значений, соответствующих уровням начала наблюдения (Таблица 2).

Таблица 2 – Агрегационная функция тромбоцитов у телят ярославской породы молочнорастительного питания

Показатель	Возраст телят ярославской породы, n=42, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Время развития AТ с АДФ, с	33,2±0,11	22,8±0,39 Р<0,01	28,6±0,20 Р<0,05	29,1±0,16 Р<0,05	33,4±0,18
Время развития AТ с коллагеном, с	27,8±0,18	18,6±0,28 Р<0,01	22,7±0,16 Р<0,01	23,2±0,14 Р<0,05	27,1±0,10
Время развития AТ с тромбином, с	45,5±0,15	35,6±0,25 Р<0,01	38,5±0,19 Р<0,05	41,1±0,13 Р<0,05	45,7±0,14
Время развития AТ с ристомицином, с	46,8±0,20	33,1±0,36 Р<0,01	37,8±0,23 Р<0,05	39,6±0,25 Р<0,05	42,9±0,19
Время развития AТ с адреналином, с	86,6±0,26	72,9±0,39 Р<0,01	75,2±0,24 Р<0,05	77,2±0,26 Р<0,05	84,5±0,20 Р<0,05

Исходно небольшое содержание в тромбоцитах телят аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата возрастало к 45 суткам их жизни на 15,2 % и на 15,4 %. В эти сроки наблюдалось также усиление секреции этих веществ из тромбоцитов на 36,2 и 34,6 %. Повышение этих показателей сменялось их быстрым снижением до уровня исхода к 90 суткам.

Содержание актина и миозина в неактивных тромбоцитах телят к 45 суткам возрастало на 35,7 % и на 43,0 %, в последующем понижаясь к 90 суткам до изначального уровня (37,4±0,15 % и 18,5±0,19 % общего белка в тромбоците). Это сопровождалось у телят в возрасте 45 суток в условиях агрегации тромбоцитов кратковременным ростом самосборки актина на 30,3 % и миозина на 28,9 %, которая в последующем постепенно ослабевала, достигая уровня исхода к 90 суткам жизни (Таблица 3).

Накопленные сведения дают основание считать, что гематолоческие показатели весьма значимы для сохранения гомеостаза у биологических объектов любого возраста. Становится ясно, что их можно рассматривать как маркеры изменения многих функциональных состояний [7]. Также ясна их большая значимость для оценки работы организма млекопитающих и особенно продуктивных животных. Значительный интерес у исследователей вызывает оценка возрастной динамики тромбоцитарных параметров у крупного рогатого скота высокопродуктивных по уровню удоев пород [10].

Таблица 3 – Показатели внутритромбоцитарных механизмов у телят ярославской породы молочно-растительного питания

Показатель	Возраст телят ярославской породы, n=42, M±m
	31 сутки	45 сутки	60 сутки	75 сутки	90 сутки
Количество АТФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109 тр.	5,90±0,016	6,80±0,029 Р<0,05	6,48±0,014 Р<0,05	6,39±0,015 Р<0,05	5,98±0,019
Количество АДФ в тромбоцитах до начала секреции, мкмоль/109тр.	3,82±0,009	4,41±0,024 Р<0,01	4,20±0,011 Р<0,05	4,15±0,014 Р<0,05	3,78±0,016
Выраженность секреции АТФ,%	39,2±0,17	53,4±0,32 Р<0,01	43,6±0,25 Р<0,05	42,6±0,19 Р<0,05	39,6±0,17
Выраженность секреции АДФ,%	49,1±0,09	66,1±0,19 Р<0,01	59,3±0,15 Р<0,01	56,5±0,12 Р<0,05	49,2±0,16
Уровень восстановления АТ при проведении КАП, %	82,9±0,08	98,7±0,27 Р<0,05	96,7±0,20 Р<0,05	91,4±0,19 Р<0,05	86,2±0,15
Уровень восстановления АТ при проведении КИП, %	48,1±0,11	61,2±0,23 Р<0,01	56,9±0,14 Р<0,05	54,3±0,18 Р<0,05	49,1±0,16
Уровень АТ в простой пробе переноса, %	37,9±0,09	49,4±0,31 Р<0,01	47,4±0,12 Р<0,01	42,0±0,09 Р<0,05	38,1±0,12
Количество актина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	36,7±0,10	49,8±0,19 Р<0,01	44,3±0,06 Р<0,01	42,5±0,17 Р<0,05	37,4±0,15
Количество актина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	44,2±0,17	57,6±0,25 Р<0,01	54,3±0,16 Р<0,01	52,2±0,11 Р<0,05	46,0±0,14
Количество миозина в неактивных тромбоцитах,% к общему белку в тромбоцитах	17,9±0,16	25,6±0,31 Р<0,01	23,0±0,22 Р<0,01	20,4±0,17 Р<0,05	18,5±0,19
Количество миозина в тромбоцитах при АДФ-агрегации,% к общему белку в тромбоцитах	35,4±0,12	45,6±0,27 Р<0,01	42,8±0,18 Р<0,01	40,7±0,14 Р<0,05	37,1±0,17

Оценка активности тромбоцитов в течение онтогенеза способна открыть возможность понимания механизмов формирования их высокой продуктивности и эффективно создавать условия сохранения и повышения хозяйственно полезных качеств телят и коров [11]. Последовательное изучение функций тромбоцитов у телят высокоудойных пород также поможет выяснить ее динамику в процессе хозяйственного использования крупного рогатого скота и в последующем связать ее с динамикой многих физиологических показателей в различных возрастах. Данные пробелы в системе знаний побудили к проведению настоящего исследования на телятах ярославской породы, являющейся весьма продуктивной [9].

По результатам проведения оценки

АТ, вызванной коллагеном и ристомицином у телят ярославской породы в возрасте 45 суток отмечена кратковременная активация процесса тромбоцитарной адгезии, устраняющаяся к концу наблюдения. Видимо, ее усиление реализовывалось по двум механизмам [1]. Пиковая активация тромбоцитарного ответа на добавление коллагена у телят ярославской породы в этом возрасте, очевидно, связана с кратковременным повышением на тромбоцитах числа гликопротеидов Iа–IIа и VI, являющихся рецепторами к коллагену. Также механизмом активизации адгезии тромбоцитов у наблюдавшегося молодняка к 45 суткам жизни можно считать кратковременное повышение на их поверхности числа гликопротеидов Ib, являющихся рецепторами к молекулам фактора Виллебранда. Видимо, это сопровождалось эпизодом повышения в их крови содержания этого вещества. Данные изменения подтверждались выявленным у наблюдаемых телят непродолжительным ускорением в возрасте 45 суток АТ с ристомицином.

Найденное у молодняка 45-суточного возраста усиление агрегации тромбоцитов формировало оптимум защиты организма от кровопотери. Видимо этот эффект обеспечивался за счет сильного, но кратковременного напряжения многих регуляторных систем. Наступающая в возрасте 45 суток активация у телят ярославской породы АТ в ответ на сильные индукторы (коллаген и тромбин) была во многом связана с увеличением плотности рецепторов к ним на поверхности тромбоцитов телят. Это способствовало непродолжительной активации фосфолипазы С и фосфоинозитольного пути, а также повышения степени фосфолирирования белков тромбоцитарной сократительной системы. Кроме того, это происходило у телят в этом возрасте за счет образования в тромбоцитах инозитолтрифосфата, вызывающего быстропроходящее усиление выхода Са2+ из плотных гранул [6].

Выявленная аналогичная динамика

АТ у обследованных телят в ответ на слабые стимуляторы агрегации (аденозиндифосфат и адреналин) также дает возможность раскрыть изменения основных механизмов этого явления. Развивающееся у обследованного молодняка пиковое ускорение АТ в отношении этих индукторов является следствием быстропроходящего увеличения у них в возрасте 45 суток плотности рецепторов к ним на тромбоцитах, непродолжительного усиления экспрессии фибриногеновых рецепторов (GPIIb-IIIа) и роста активности тромбоцитарной фосфолипазы А 2 . Кратковременная интенсификация выщепления из фосфолипидов мембран арахидоната рассматривается как важная основа непродолжительной активации синтеза тромбоксана А 2 [8]. Также важным механизмом кратковременного усиления его синтеза можно считать выявленное с помощью проб переноса пиковое усиление у телят в возрасте 45 суток активности циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы, быстро ослабевающее до исходного уровня. Весьма важным для короткого ускорения АТ у телят при испытании слабых индукторов является быстрое нарастание в их тромбоцитах процессов актинообразования и миозинообразования, а также усиления секреции из гранул тромбоцитов аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата [4].

Значительная активизация ранних этапов участия тромбоцитов в гемостазе у телят ярославской породы в возрасте 45 суток подтверждалась в ходе оценки их внутрисосудистой агрегации путем фазовоконтрастной микроскопии. Найденный у обследованных телят в 45-суточном возрасте пиковый рост числа активированных тромбоцитов указывал на кратковременное повышение у них уровня чувствительности к внешним стимулам тромбоцитов. Выявленные изменения указывали на развитие у животных в этом возрасте снижения целостности эндотелиального слоя сосудов. Также это говорило о непродолжительном повышении в крови 45 суточных телят ярославской породы растворимых индукторов тромбоцитарной агрегации. Это вело к увеличению доступности для крови сосудистого коллагена, мощно стимулирующего тромбоциты. Очевидно, эти явления во многом способствовали кратковременному росту числа свободно циркулирующих агрегатов тромбоцитов.

Выявленное короткое усиление агрегации тромбоцитов у обследованных животных, начавших поедать растительные корма, вело к быстро устраняющемуся повышению уровня их активных форм и разного размера их агрегатов. Видимо, найденные изменения в активности тромбоцитов у телят, призваны обеспечить минимизацию опасности кровотечений и гемодинамической блокады агрегатами функционально необходимого числа микрососудов во всех органах. Данные изменения поддерживали в границах физиологической нормы тромбоцитарнососудистые взаимодействия. Найденное ускоренное возвращение к значениям исхода внутрисосудистой агрегации тромбоцитов у молодняка ярославской породы во второй половине фазы молочнорастительного питания обеспечивает сохранение оптимума функционирования первичного гемостаза и четкий баланс между процессами протромботической и антитромботической направленности. Сбалансированность их активности у телят ярославской породы в течение фазы молочно-растительного питания в полной мере обеспечивает оптимум в первичном гемостазе и сдерживает активность тромбоцитов в ходе адаптации организма животных к началу потребления растительных кормов.

Заключение. Для телят ярославской породы в первой половине фазы молочнорастительного питания свойственно недолгое усиление гемостатических свойств тромбоцитов. Активация тромбоцитарных функций у этих телят связана с кратковременным ростом у них активности механизмов адгезии, агрегации и секреции тромбоцитов. Этот процесс связан с началом поступления в их организм кормов растительного состава.

Короткое усиление активности тромбоцитов у молодняка ярославской породы в возрасте 45 суток, видимо, имеет адаптивный характер и призвано обеспечивать оптимум кровотока в сосудах и метаболизма в тканях и внутренних органах на фоне начала растительного питания.

Резюме

Цель работы – проследить динамику активности тромбоцитов у телят молочнорастительного питания ярославской породы. Исследование выполнили на 42 телятах ярославской породы, которых получили после 2-3 стельности от полностью здоровых коров. У животных найдено ускорение наступления агрегации тромбоцитов под действием всех примененных индукторов к 45 суткам жизни, устраняющееся к концу проведенного наблюдения. При этом в крови животных в возрасте 45 суток отмечался кратковременный рост количества активированных тромбоцитов на 27,9 %. Кратковременное усиление активности тромбоцитов в возрасте 45 суток жизни наступило во многом за счет роста на 30,3% синтеза в них тромбоксана. Большую значимость в этом имело кратковременное повышение уровня в тромбоцитах аденозинфосфатов и пиковое усиление процесса их секреции. Процесс кратковременного усиления у телят к 45 суткам жизни тромбоцитарной активности также обеспечивался увеличением количества в тромбоцитах актина и миозина на 35,7 и 43,0 %, с возвращением их уровней до исхода к концу наблюдения. У животных в агрегирующих тромбоцитах к 45 суткам жизни наступало усиление дополнительного синтеза актина и миозина на 35,7 и 43,0 %, соответственно, которое нивелировалось к концу наблюдения.