Гематологические и гемодинамические показатели у кроликов (Oryctolagus cuniculus subsp. Domesticus) под влиянием внутримышечной инъекции трипсина

Кристаллический трипсин не находит широкого применения в медицинской и ветеринарной практике из-за ограниченного числа показаний и болевой реакции, которой сопровождается внутримышечная инъекция препарата.

Однако в последние годы наметился интерес к изучению трипсина как гормоноподобного вещества в организме человека и животных (1, 2) в связи с поиском средств нормализации метаболических процессов и регуляции не только функции поджелудочной железы, но и других органов и физиологических систем. Результаты исследований подтверждают наличие трипсина в крови и молоке животных (3, 4). Основанием для этого служат результаты исследования N. Koshikawa с соавт. (5) экспрессии трипсина в

^∗ Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта РНФ ¹ 23-26-00124 «Разработка способа снижения болевого синдрома при внутримышечном введении трипсина животным».

непанкреатических тканях человека и мыши, которые показали, что ген трипсина экспрессируется на высоком уровне в поджелудочной железе, селезенке и значительно — в тонком кишечнике.

Получены данные об участии трипсина в активировании PAR (protease-activated receptor) рецепторов. Установлено, что панкреатический трипсин является потенциальным активатором PAR-2 рецепторов (6). Экспериментально доказано, что протеазы и их рецепторы играют важную роль в свертывании крови, развитии воспаления, проявлении боли, заживлении ран и защите от инфекций (7-9). Известно (10, 11), что PAR-2 рецепторы вовлечены в передачу сигналов возникновения боли при раке поджелудочной железы in vivo. Это дает основание предположить участие PAR-2 рецепторов в возникновении боли при внутримышечном введении трипсина. Устранение такого побочного эффекта при инъекциях препарата трипсина важно для расширения его применения в ветеринарной и медицинской практике.

В представляемом исследовании впервые предпринята попытка изучить действие кристаллического трипсина в дозе 0,25 мг/кг живой массы кролика на показатели кровообращения (АД, ЧСС, ЧДД) и гематологический статус животных при использовании физиологического раствора и лидокаина в качестве разбавителя препарата.

Целью настоящей работы было определение морфо-биохимических показателей крови и кровообращения у кроликов, которым вводили внутримышечно препарат трипсина, разбавленный физиологическим раствором или лидокаином.

Методика . Для эксперимента сформировали три группы кроликов породы шиншилла (по 10 животных в группе) с живой массой 3957±66,5 г. Животные находились в металлических клетках КР-ВПО-3.6 (Россия) в виварии (РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2023 год) при оптимальных условиях содержания (температура 18-26 ° С , относительная влажность 30-70 %). Кролики получали полнорационный комбикорм (ГОСТ 32897-2014) в количестве 100-110 г ежесуточно двумя порциями (2 раза в сутки). Эксперименты выполняли методом групп-периодов. Всех животных разделили на три группы по принципу аналогов: 1-й группе (контроль) внутримышечно вводили трипсин, разбавленный физиологическим раствором в соотношении 0,01 г трипсина в 5,0 мл физиологического раствора, в количестве 0,5 мл (0,25 мг/кг живой массы); 2-я группа (опыт) получала инъекцию трипсина, разбавленного лидокаином (0,01 г кристаллического трипсина в 5,0 мл 2,0 % раствора лидокаина), в количестве 0,5 мл (0,25 мг/кг живой массы); 3-й группе (опыт) внутримышечно вводили 2,0 % раствор лидокаина в количестве 0,5 мл. Эксперименты были разделены на три периода. Перед внутримышечной инъекцией препарата у животных измеряли артериальное давление (АД, тонометр petMAP graphic II, «Ramsey Medical, Inc.», США); частоту сердечных сокращений (ЧСС) и частоту дыхательных движений (ЧДД) определяли, используя фонендоскоп. Вводили препарат и сразу измеряли АД, ЧСС, ЧДД; повторно определяли показатели через 30 мин после внутримышечной инъекции препарата. Исследования выполняли в 5 повторностях.

Для выполнения морфо-биохимических исследований крови формировали по принципу аналогов три группы (по 10 животных в каждой). Кроликам 1-й группы (контроль) вводили внутримышечно физиологический раствор в количестве 0,5 мл с целью определения фонового уровня основных показателей. Кроликам из 2-й группы (опыт) вводили внутримы- шечно трипсин в дозе 0,25 мг/кг живой массы, разведенный физиологическим раствором. Кроликам 3-й группы (опыт) вводили внутримышечно трипсин в дозе 0,25 мг/кг живой массы, разбавленный раствором лидокаина. Кровь брали из ушной вены через 60 мин после инъекции, используя специальные вакуумные пробирки с наполнителем оксидом кремния (SiO2) и антикоагулянтом (К3-EDTA) для гематологического анализа.

Активность трипсина определяли на биохимическом анализаторе BS-3000M («Sinnowa», КНР) с субстратом N-бензоил-DL-аргинин-n-нит-роанилидом (БАПНА) (12). Биохимические показатели крови исследовали с помощью автоматического биохимического анализатора BioChem FC-120 («High Technology, Inc.», США) с набором реактивов этой же компании. Морфологические показатели крови определяли с помощью автоматического гематологического анализатора MicroCC (вариант исполнения Micro-CC20Plus, MCC-2002-VO-RU, «High Technology, Inc.», США).

Статистическую обработку данных проводили по алгоритмам программы Excel с использованием t -критерия Стьюдента для малых групп. Результаты представлены как средние ( M ) и стандартные отклонения (±SD), изменения показателей считали достоверными при p < 0.05.

Результаты . В опыте для разведения кристаллического трипсина использовали два разбавителя — физиологический раствор или лидокаин (2 мг/мл). Для этого по 5,0 мл одного из растворов добавляли во флакон с трипсином. Так как эксперимент выполняли методом групп-периодов, в фоновый период определяли показатели кровообращения у кроликов до инъекции трипсина, затем повторяли процедуру дважды — сразу после инъекции и еще через 30 мин после инъекции (табл. 1).

1. Показатели кровообращения у кроликов ( Oryctolagus cuniculus subsp. domesticus ) породы шиншилла после внутримышечной инъекции трипсина ( n = 10, M ±SD, РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2023 год)

Период Давление, мм рт. ст. Пульсовое давление, мм рт. ст. Частота, ед/мин систолическое диастолическое сердечных сокращений дыхательных движений Фоновый Трипси 177±6,5 н + физиологический 121±4,9         56±3,6 раствор 225±12,5 159±8,6 После инъекции; 0 мин 186±3,0 105±3,3 81±1,9a 224±6,7 165±3,4 30 мин 173±3,5 107±3,7 66±3,8 168±1,6a 159±4,7 Фоновый Трипсин+2% раст 177±4,0          110±3,8 вор лидо 67±2,8 каина 239±1,1 165±2,0 После инъекции; 0 мин 181±6,6 120±4,5 61±5,4 224±3,4a 178±10,3 30 мин 175±5,8 111±4,0 64±3,0 176±4,4ab 175±4,5 Фоновый 188±7,5 2% раствор лидокаина 127±5,0         61±6,0        228±4,8 178±3,3 После инъекции; 0 мин 178±4,1 121±4,8 57±4,6 241±3,2 169±3,0 30 мин 177±6,0 119±1,2 58±5,4 216±2,0ab 164±5,0 a Различия с фоновым уровнем статистически значимы при p < 0,05.

b Различия между показателями через 30 мин и сразу после инъекции трипсина статистически значимы при p < 0,05.

Результаты показали, что при использовании физиологического раствора в качестве разбавителя трипсина наиболее существенно изменялось пульсовое давление, которое увеличивалось на 44,6 % (p < 0,05), а через 30 мин после инъекции снижалось до фонового уровня. Частота сердечных сокращений уменьшалась через 30 мин после инъекции препарата на 25,3 % (p < 0.05). Наиболее выраженные изменения отмечались при использовании 2 % раствора лидокаина в качестве разбавителя: частота сердечных сокращений уменьшалась сразу после инъекции на 6,3 % (p < 0,05), по истечении 30 мин — на 26,4 % (p < 0,05).

Для оценки действия трипсина на фоне лидокаина кроликам вводили отдельно 0,5 мл лидокаина. Результаты показали, что частота сердечных сокращений снижалась через 30 мин после инъекции лидокаина на 5,3 % (p < 0,05). Это дает основание полагать, что трипсин на фоне лидокаина обладает способностью вызывать у кроликов брадикардию.

2. Морфологические показатели крови у кроликов ( Oryctolagus cuniculus subsp. domesticus ) породы шиншилла через 60 мин после внутримышечной инъекции трипсина с разными разбавителями ( n = 10, M ±SD, РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2023 год)

Показатель	Группа
	1-я (контроль)	2-я (опыт)	3-я (опыт)
Лейкоциты, ½109/л	6,3±0,51	4,5±0,83	5,1±0,57
Лимфоциты, %	41,8±3,74	42,5±3,87	45,5±3,8
Гранулоциты, %	51,6±3,89	50,2±3,83	48±3,6
Индекс иммунореактивности	6,9	6,3	7,7
Отношение гранулоцитов к лимфоцитам	1,2	1,2	1,1
Эритроциты, ½1012/л	5,3±0,28	5,6±0,22	5,9±0,24
Гемоглобин, г/л	148±3,5	139±4,4	137±5,4
Гематокрит, %	40±0,9	37±1,5	38±1,3

Через 60, 180 мин и 1 сут значения АД, ЧСС и ЧДД не отличались от фоновых за предыдущие сутки: трипсин действует через нервную систему и быстро (в течение 30-60 мин) инактивируется в организме кроликов.

Морфологические и биохимические показатели крови (табл. 2, 3) относятся к наиболее важным клиническим характеристикам при адаптации организма к фармакологическим препаратам. Полученные нами результаты свидетельствуют, что существенных изменений после внутримышечной инъекции трипсина в морфологических показателях крови не происходило, хотя ранее (13) в варианте трипсин + физиологический раствор через 60-90 мин отмечали значительные изменения по числу лимфоцитов, нейтрофилов и эритроцитов относительно контроля (физиологический раствор). Такое расхождение результатов можно объяснить тем, что исследования проводились на кроликах разного возраста.

3. Биохимические показатели крови у кроликов ( Oryctolagus cuniculus subsp. domesticus ) породы шиншилла через 60 мин после внутримышечной инъекции трипсина с разными разбавителями ( n = 10, M ±SD, виварий РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2023 год)

Показатель Группа 1-я (контроль) 2-я (опыт) 3-я (опыт) Амилаза, ед/л 146±5,8 143±7,9 131±3,9 Трипсин, ед/л 71±2,1 81±4,0a 65±7,5 Общий белок, г/л 68±1,1 67±1,1 67±0,6 Глюкоза, ммоль/л 5,4±0,77 5,1±0,65 2,1±0,10ab Триглицериды, ммоль/л 1,0±0,10 1,0±0,04 0,7±0,06ab Холестерин, ммоль/л 2,2±0,20 2,7±0,18 2,0±0,05 Щелочная фосфатаза, ед/л 233±12,6 231±29,2 158±3,2ab Кальций, ммоль/л 3,6±0,15 3,6±0,04 3,7±0,10 Фосфор, ммоль/л 2,7±0,33 2,7±0,27 3,1±0,28 a Различия с фоновым уровнем статистически значимы при p < 0,05.

b Различия между показателями через 30 мин и сразу после инъекции трипсина статистически значимы при p < 0,05.

Биохимический анализ крови показал (см. табл. 3), что после инъекции препарата трипсина, приготовленного на физиологическом растворе, активность трипсина в крови кроликов повышалась на 14,1 % (p < 0,05). Трипсин, разбавленный 2 % раствора лидокаина, заметно влиял на другие показатели сыворотки крови. Содержание глюкозы снижалось на 61,1 % (p < 0,05) по сравнению с контролем и на 58,8 % (p < 0,05) по сравнению с группой, получившей инъекцию трипсина, разведенного в физиологическом растворе, количество триглицеридов уменьшалось соответственно на 0 и 30 % (p < 0,05), активность щелочной фосфатазы — на 32,2 % (p < 0,05) по сравнению с контролем и на 31,6 % (p < 0.05) по сравнению со 2-й группой (опыт).

Наличие трипсина в активной форме в сыворотке крови кролика установлено еще в 1975 году В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (14). Авторы статьи утверждали, что ингибитор трипсина в сыворотке крови необратимо связывает фермент. Кроме того, ингибитор трипсина был получен из сыворотки крови человека, из мочи и бронхиального секрета и идентифицирован как одно и то же вещество, выполняющее в организме сходную физиологическую функцию. При определении активности трипсина биохимическим методом в большинстве случаев используют в качестве субстрата для гидролиза N-бензол-DL-аргинин-паранитроанилид (15). Трипсин (КФ 3.4.21.4) используется в медицине как противовоспалительный, противоотечный, ранозаживляющий агент, а также в качестве антигельминтного препарата (16). Продолжение фундаментальных исследований действия ферментов позволит получить новые знания о роли трипсина в метаболизме у животных и человека и расширить область применения этого фермента в медицине и ветеринарии.

Наши экспериментальные данные по изучению комбинации трипсина с разными разбавителями показали, что при использовании физиологического раствора у кроликов отмечалась болевая реакция, которая проявлялась отдергиванием тазовой конечности при инъекции. Это можно связать с влиянием трипсина на проницаемость кровеносных сосудов в процессе активации кининов (17), а также с воздействием на PAR-2 рецепторы, находящиеся в тканях (18). Кинины представляют собой провоспалитель-ные пептиды, которые опосредуют многочисленные сосудистые и болевые реакции на повреждение тканей (19). Для этих пептидов идентифицированы и охарактеризованы два фармакологически различных подтипа рецепторов кинина. Они названы B1 и B2 и принадлежат к семейству родопсиновых рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), который участвует в сиг-налинге через путь фосфолипазы C, ведущий к образованию инозитол-3-фосфата (IP3) и внутриклеточной мобилизации Ca2+ (20, 21). Также признана роль брадикинина как мощного стимулятора эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) через сигнальный путь B2 рецептора (22).

Внутримышечно применение препарата трипсина, приготовленного на физиологическом растворе, повышало пульсовое давление у кроликов на 44,6 % по сравнению с исходным показателем. Изменение пульсового давления считают одним из критериев для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний в медицине (23, 24). Следовательно, наличие у кроликов болезненной реакции при инъекции трипсина на первом этапе проявляется в изменении показателя, связанного с артериальным давлением, а в дальнейшем — в изменении частоты сердечных сокращений, которая через 30 мин снижается на 25,3 % (p < 0,05). Это можно объяснить влиянием на сердечную деятельность импульсов, приходящих по парасимпатическим нервам, которые угнетают работу сердца, что, вероятно, связано с функцией пептидов (брадикинин и каллидин), которые вырабатываются и действуют в месте повреждения ткани или воспаления. Они вызывают различные эффекты посредством активации специфических рецепторов B1 или B2, которые связаны с различными механизмами биохимической трансдукции. Кининам приписывается ряд других действий, включая влияние на передачу сигналов боли как в головном мозге (что может быть связано с сосудистой головной болью), так и в спинном мозге, где могут стимулироваться первичные афферентные ноцицепторы (25). В опытах на птице установлена зависимость повышения активности трипсина в постпрандиальную фазу пищеварения одновременно в дуоденальном содержимом и крови, что также можно объяснить рефлекторным влиянием с участием парасимпатических нервов и метаболитов оксида азота (26-28). Эксперименты, выполненные на кроликах, наглядно показали участие трипсина в регуляции сердечной деятельности, что связано, по-видимому, с действием на парасимпатическую иннервацию, регулирующую сердечную функцию (29). О роли вегетативной нервной системы в возникновении боли при инъекции раствора трипсина известно пока немного. Предлагаемые механизмы возникновения болевых реакций — повышенная чувствительность поврежденных сенсорных нервов к катехоламинам, увеличенная экспрессия a-1-адренорецепторов на первичных афферентных ноцицепторах и при гиперальгезии кожи (аномально высокая чувствительность к болевым стимулам), центральная сенсибилизация механорецепторов Ae, увеличенный разряд и симпатический рост в ганглиях дорсальных корешков, центральная сенсибилизация и дисфункция модуляции боли (30).

В опыте с применением лидокаина в качестве разбавителя трипсина были получены данные, которые указали на снижение частоты сердечных сокращений у кроликов. Это может быть связано с влиянием лидокаина на вегетативную нервную систему. Лидокаин как препарат, относящийся к группе местных анестетиков, достаточно давно занял свое место в арсенале противоаритмических лекарственных средств (31). Среди основных клинических проявлений нежелательных реакций при применении лидокаина в литературе выделяют нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы, центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта (32). С этим согласуются результаты, полученные в наших опытах с использованием внутримышечно 2,0 % лидокаина в количестве 0,5 мл.

В дальнейшем мы планируем изучить экспрессию генов, связанных с PAR-2 рецепторами, при внутримышечном введении трипсина, чтобы уточнить механизм возникновения боли и влияние различных анальгетиков на ее устранение.

Итак, эффект, оказываемый трипсином на кровообращение у кроликов, связан с уменьшением частоты сердечных сокращений независимо от разбавителя препарата трипсина. При использовании лидокаина это действие проявляется сильнее, поскольку лидокаин сам обладает способностью снижать частоту сердечных сокращений. Кристаллический трипсин, разбавленный физиологическим раствором и введенный кролику внутримышечно, увеличивает активность трипсина в крови на 14,1 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. При разбавлении трипсина лидокаином с целью уменьшения болевой реакции на внутримышечную инъекцию изменяются несколько биохимических показателей сыворотки крови, что предположительно связано с эффектом лидокаина. Так, содержание глюкозы снижается на 61,1 % (р < 0,05), количество триглицеридов — на 30,0 % (р < 0,05), активность щелочной фосфатазы — на 32,2 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, тогда как при применении в качестве разбавителя физиологического раствора существенных изменений мы не наблюдали. Следовательно, использование лидокаина как разбавителя оказывает влияние на показатели крови, связанные с энергетическим обменом, что может уменьшать положительное влияние трипсина на регуляцию метаболизма в организме животных.