Ген CLAVATA3 (CLV3) как перспективный генетический маркер для дифференциальной диагностики популяций Heterodera glycines от других близкородственных видов

Научная статья УДК 631.522:632

Введение. Для решения актуальных проблем в области агрономии требуется разработка инновационных методов диагностики и защиты сельскохозяйственных культур от патогенов и вредителей, среди которых соя ( Glycine max ), ввиду её значительной роли в мировом сельском хозяйстве, заслуживает особого внимания.

Распространению вирулентных форм соевой цистообразующей нематоды Heterodera glycines (Ichinohe, 1952) способствуют такие факторы, как непрерывная эволюция патогена, трансформация окружающей среды и антропогенное воздействие человека. Это создает серьезную проблему для мировой индустрии выращивания сои. Например, в Китае нематода H. glycines встречается повсеместно в регионах возделывания культуры. Культивирование восприимчивых сортов ведет к снижению урожайности и экономическим убыткам производителей. При этом эффективных мер контроля с паразитом пока разработано недостаточно [1–3].

Наблюдается тенденция изменения состава популяций соевой нематоды и появление новых вирулентных форм [1; 4]. Количество вирулентных патотипов соевой нематоды (HG-types), отличающихся повышенной вредоносностью, увеличивается ежегодно [5; 6; 2]. Эти изменения могут быть связаны с адаптацией паразита к изменяющимся условиям окружающей среды под влиянием климатических факторов.

Все эти факты позволяют рассматривать распространение соевой цистообразующей нематоды, как растущую угрозу для устойчивого развития производства сои на Дальнем Востоке России, тесно граничащим с Китаем, откуда возможно проникновение данного фитопаразита.

Морфологический анализ цистообразующих нематод, принадлежащих к группе Schachtii (Sensu stricto) рода Heterodera , в которую входят H. glycines, H. schactii, H. trifolii и H. sojae , практически невозможен из-за схожих морфологических характеристик между родственными видами, затрудняющими идентификацию каждого [7; 8].

Молекулярные методы, несмотря на сокращение времени, затрат и трудоемкости обнаружения, ограничены недостаточной специфичностью вследствие гомологий в ядерных и митохондриальных генетических областях, служащих основой для разработки генетических маркеров. Это затрудняет точное различие H. glycines от других представителей группы Schachtii. Помимо этого, на точность идентификации и количественной оценки H. glycines непосредственно в почве могут оказывать влияние разнообразные биологические, эдафические, химические или физические факторы, связанные с экстракцией почвенной ДНК [9].

Фитопаразитические нематоды, являясь биотрофами, инфицируя растения, вводят при этом эффекторные белки из желез пищевода, что обеспечивает их успешное внедрение и развитие в тканях хозяина.

Пептиды семейства CLE играют ключевую роль в регуляции взаимодействия растений с патогенными организмами, особенно теми, которые провоцируют аномальное деление клеток и изменение их нормальной дифференцировки [10].

Важно отметить, что некоторые фито-патогенные нематоды выделяют пептиды, подобные растительным CLE-пептидам, демонстрируя функциональное и структурное сходство [11–15]. Заметным примером служит нематода H. glycines , паразитирующая на корнях растений и способствующая образованию цист. Геном данной нематоды включает гены, кодирующие пептиды CLE, активно экспрессирующиеся именно в клетках её пищеводных желёз – специализированных структурах, обеспечивающих успешность инфицирования хозяина [16].

Растения же сами обладают множеством генов CLAVATA3 (CLV3), которые отвечают за синтез небольших сигнальных пептидов, регулирующих процессы развития организма. Эти пептиды выполняют важную гормональную функцию и были впервые идентифицированы ещё в конце XX века [17; 18]. Белок CLAVATA3 контролирует рост и развитие верхушечной меристемы стебля путём взаимодействия с соответствующим мембранным рецептором, регулируя количество и активность клеток меристемы [19].

Изначально пептиды семейства CLE рассматривались исключительно как регуляторы роста и развития растений. Позже было установлено, что паразиты используют аналогичные молекулы для управления клеточными процессами хозяев, повышая свою способность успешно заражать растение-хозяин. Пептиды семейства CLE были функционально охарактеризованы у соевой цистообразующей нематоды H. glycines и картофельной цистообразующей нематоды G. rostochiensis – двух наиболее важных с агрономической точки зрения видов цистообразующих нематод [14; 16; 20]. Сообщалось также о последовательностях генов, кодирующих подобные CLE-пептиды, выделенных из H. schachtii [16; 21].

Учитывая тот факт, что CLAVATA3 (CLV3) является геном паразитизма, он потенциально может служить эффективным молекулярным маркером для дифференциации близких видов внутри группы Schachtii рода Heterodera , учитывая способность этого гена кодировать вариабельные домены, отличающиеся у разных видов.

Таким образом, цель исследования заключалась в изучении гена, кодирующего CLAVATA3-подобный пептид (CLV3), экспрессируемый нематодами, и оценке его возможности служить молекулярным маркером для идентификации и диагностики различных популяций соевой цистообразующей нематоды H. glycines.

Конкретные задачи исследования включали апробацию полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанную на анализе гена, кодирующего CLAVATA3-по-добный пептид (CLV3), для точной идентификации и дифференциации популяций H. glycines от других близкородственных видов, встречающихся в почве.

Материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории гельминтологии Испытательного лабораторного центра ФГБУ «ВНИИКР». Для проведения исследований использовали популяции соевой нематоды H. glycines , отобранные с корней растений сои, и популяции свекловичной нематоды H. schachtii , отобранные из почвы.

В качестве нецелевых объектов использовали образцы ДНК других видов нематод рода Heterodera из коллекции лаборатории ФГБУ «ВНИИКР»: капустная цистообразующая нематода H. cruciferae, морковная цистообразующая нематода H. carotae и клеверная цистообразующая нематода H. trifolii.

Экстракция ДНК из цист нематод, ранее полученных из почвенного образца, проводилась с использованием коммерческого набора «ДНК-Экстран-2» (ЗАО «Синтол») [22]. Процесс экстракции осуществлялся посредством обработки образцов лизирующим раствором и ферментативной деградации белков протеиназой K, строго по рекомендациям производителя. Для разрушения клеточных структур нематоды подвергались гомогенизации, после чего их инкубировали в лизирующем растворе, содержащем протеиназу K, при температуре 56 °C в течение нескольких часов. Для оценки концентрации и чистоты полученной ДНК использовали спектрофотометр NanoDrop 2000, который позволил провести количественное определение содержания ДНК.

Секвенирование полученных ампликонов было выполнено с применением набора «Big Dye Terminator Kit v 3.1» на генетическом анализаторе Genetic Analyzer AB-3500.

Апробация праймеров. В рамках исследования были использованы синтетические лиофилизированные праймеры, изготовленные фирмой ЗАО «Евроген» (Россия), растворение которых в стерильной воде позволило достичь рабочей концентрации праймеров 10 ρmol/μl, необходимой для экспериментального анализа.

Классическая ПЦР. Для диагностики H. glycines использовали пару праймеров (CLE1F/CLE1R), нацеленную на сегменты генов CLE цистообразующих нематод H. glycines и H. schachtii [23]. Данную пару праймеров использовали для амплификации и секвенирования последовательностей CLE популяций H. glycines и популяций H. schachtii.

Амплификация исследуемого фрагмента была выполнена посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция проводилась в объеме 25 мкл и содержала следующие реагенты: готовая реакционная смесь 5xScreenMix-HS («Евроген») – 5 мкл, праймеры CLE1F и CLE1R по 1 мкл каждый, 16 мкл деионизованной воды, а также образец ДНК-матрицы – 2 мкл. Реакцию осуществляли в термоциклере CFX96 «Bio-Rad» согласно следующему протоколу: предварительная денатурация – 2 мин при температуре 94 °C, далее цикл повторяли 50 раз (каждый цикл состоял из трех стадий: денатурация – 10 сек при 95 °C, отжиг – 45 сек при 62 °C, элонгация цепи ДНК длительностью 1 мин при 72 °C). После завершения основных циклов проводился заключительный этап удлинения нуклеотидной последовательности в течение 10 мин при 72 °C.

Фрагменты ДНК после выполнения электрофореза были подвергнуты секвенированию, а затем обработаны методами биоинформатического анализа. Программное обеспечение «BioEdit» использовалось для выравнивания и редактирования нуклеотидных последовательностей. Далее полученные данные сравнивали с информацией базы BLAST NCBI, что дало возможность провести углубленное исследование.

Классическая ПЦР с видоспецифичными праймерами. Для дифференциации близкородственных видов использовали две пары видоспецифичных праймеров: SCNCLEF/SCNCLER для H. glycines и SBCNCLEF/SBCNCLER для H. schachtii .

В качестве нецелевых объектов брали образцы ДНК других видов нематод: капустная цистообразующая нематода H. cruciferae , морковная цистообразующая нематода H. carotae и клеверная цистообразующая нематода H. trifolii .

Для идентификации видов нематод H. glycines и H. schachtii использовали видоспецифичные праймеры SCNCLEF/ SCNCLER и SBCNCLEF/SBCNCLER соответственно. Реакция проводилась в объёме 25 мкл, включая: 2 мкл матричной ДНК, 5 мкл готовой реакционной смеси 5xScreenMix-HS («Евроген»), по 1 мкл каждого праймера и 16 мкл деионизованной воды, свободной от нуклеаз.

Режимы ПЦР имели различие: для H. glycines выполняли 35 циклов при температуре отжига 59 °C, а для H. schachtii – 40 циклов с температурой отжига 65,5 °C.

Результаты и обсуждение. Ампли- фикацию продуктов полученной классическим методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР с видоспецифичными праймерами оценивали визуально путем электрофореза в агарозном геле (концентрация 1,5 %) с добавлением красителя – бромистого этидия. Электрофорез проводился в специальных камерах отечественного производства от компаний «ДНК-Технология» и «Хеликон».

Исследование, проведенное с использованием пары праймеров CLE1F/CLE1R для амплификации и секвенирования фрагмента гена CLE у трех популяций нематод H. glycines и двух популяций нематод H. schachtii , демонстрирует высокую эффективность данного подхода. Применение выбранных праймеров позволило амплифицировать участки генома размером 500 п.н. для H. glycines и 650 п.н. для H. schachtii. Это указывает на то, что использованные праймеры обладают достаточной специфичностью и чувствительностью для детекции интересующих участков генома, в частности гена CLE, исследуемых видов нематод (рис. 1).

Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных методом гель-электрофореза:

1, 2, 3 – образцы ДНК H. glycines ; 4, 5 – образцы ДНК H. schachtii ; k- – отрицательный контроль (вода); m – маркер молекулярного веса

(от 100 до 1500 п.н.)

Fig. 1 – Electrophoregram of PCR products obtained by gel electrophoresis:

• 1,    2, 3 – H. glycines DNA samples; 4, 5 – H. schachtii DNA samples; k- – negative control (water); m – molecular weight marker (100–1500 bp)

Последующее секвенирование ампликонов обеспечило получение высококачественных данных, необходимых для дальнейшего анализа. Молекулярно-генетическое сравнение полученных нуклеотидных последовательностей показало их полную идентичность (100 %) с доступными последовательностями гена CLE у H. glycines (FG503005; MK686034) и CLE у H. schachtii (HM588679; MK746086), представленных в базе данных NCBI BLAST.

Важно отметить, что вновь полученные нуклеотидные последовательности были внесены в базу данных NCBI BLAST под соответствующими инвентарными номерами: CLE H. glycines (PV133908, XP086639) , что расширяет доступный пул информации для дальнейших исследований.

Результаты исследования также показывают, что использование видоспецифичных праймеров SCNCLEF/SCNCLER и SBCNCLEF/SBCNCLER эффективно для амплификации и секвенирования фрагментов гена CLE у популяций двух видов цистообразующих нематод – H. glycines и H. schachtii соответственно. Получение ампликонов заданной длины (165 п.н. для H. glycines и 289 п.н. для H. schachtii ) свидетельствуют о корректности выбранных праймеров и их способности к специфическому связыванию с комплементарными участками генома целевого вида (рис. 2).

Проверка специфичности данных праймеров на нецелевых нематодах ( H. crucife-rae , H. carotae и H. trifolii ) показала отсутствие продуктов амплификации. Это указывает на высокую степень специфичности используемых праймеров, которые способны различать целевые виды от других представителей рода Heterodera (рис. 2).

Таким образом, полученные данные подтвердили, что все анализы были высокоспецифичными, соответственно, протестированные праймерные системы, разработанные на основе гена CLAVATA3 (CLV3), кодирующего секреторный белок цистообразующих нематод, можно при- менять для обнаружения H. glycines, поскольку они обладают высокой дискриминационной способностью, позволяющей четко различать целевые виды среди прочих представителей рода Heterodera.

А (A)

Б (B)

Рисунок 2 – Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных методом гель-элек-трофореза:

А: 1, 2 – H. glycines ; 3, 4 – H. schachtii ; 5 – H. cruci-ferae ; 6 – H. carotae ; 7 – H. triolii ; k- – отрицательный контрольный образец; m – маркер молекулярного веса (от 100 до 1500 п.н.);

Б: 1, 2 – H. schachtii ; 3, 4 – H. glycines ; 5 – H. cruci-ferae ; 6 – H. carotae ; 7 – H. triolii ; k- – отрицательный контроль (вода); m – маркер молекулярного веса (от 100 до 1500 п.н.)

Fig. 2 – Electrophoregram of PCR products obtained by gel electrophoresis:

• A: 1, 2 – H. glycines ; 3, 4 – H. schachtii ; 5 – H. cruci-ferae ; 6 – H. carotae ; 7 – H. triolii ; k- – negative control sample; m – molecular weight marker (100–1500 bp); B: 1, 2 – H. schachtii ; 3, 4 – H. glycines ; 5 – H. cruci-ferae ; 6 – H. carotae ; 7 – H. triolii ; k- – negative control sample (water); m – molecular weight marker (100–1500 bp)

Установлено, что ген CLE (CLAVA-TA/ESR-related) был обнаружен лишь у некоторых родов фитонематод, таких как Heterodera, Globodera, Meloidogyne и Rotylenchulus [20; 24; 25], что указывает на его потенциальную значимость в качестве молекулярного маркера для диагностики и дифференциации отдельных видов, в данном случае H. glycines и H. schachtii. Гены, вовлеченные в специфические взаимодействия между паразитом и хозяином, такие как CLE , могут играть ключевую роль в видовой дифференциации близкородственных видов, особенно учитывая высокую степень морфологической и генетической гомологии среди представителей данной группы. Например, экспрессию CLE связывают именно с соевой цистообразующей нематодой, поражающей экономически значимую сельскохозяйственную культуру сою. Таким образом, использование CLE становится мощным инструментом точного определения конкретного возбудителя поражения культурных растений.

Применение гена CLE в данном исследовании имеет несколько важных аспектов. Во-первых, использование пары праймеров, нацеленных на сегменты генов CLE , позволяет проводить высокоспецифичную диагностику цистообразующих нематод H. glycines и H. schachtii. Это связано с тем, что эти гены являются уникальными маркерами для каждого вида, что делает возможным точное определение присутствия конкретного патогена в образцах.

Во-вторых, амплификация и последующее секвенирование последовательностей CLE позволяет получить детальную информацию о генетической структуре исследуемых популяций. Это особенно важно для понимания разнообразия и эволюции патогенов, а также для разработки эффективных мер контроля и профилактики.

Кроме того, выбор различных мест сбора материала для исследования подчеркивает географическое распределение и потенциальные различия между популяциями разных видов. Такой подход помогает оценить степень распространения заболеваний, вызываемых этими нематодами, и разработать стратегии борьбы с ними, адаптированные к местным условиям.

Следует подчеркнуть, что внедрение современных технологических подходов в диагностику обеспечивает повышение эффективности и позволяет получать точные данные с минимальным количеством исходного материала в сжатые сроки, что делает его весьма ценным инструментом для анализа образцов.

Внедрение в практику будет способствовать эффективному мониторингу популяций соевой цистообразующей нематоды и разработке действенных стратегий борьбы с этим вредоносным организмом.

Заключение. Данное исследование представляет собой сообщение об успешном использовании гена паразитизма CLAVATA3 ( CLV3 ) в качестве диагностического маркера для идентификации разных популяций соевой цистообразующей нематоды H. glycines .

Полученные результаты доказали высокую эффективность применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами, разработанными на основе гена CLAVATA3 ( CLV3 ), для надежной идентификации и дифференциации видов цистообразующих нематод рода Heterodera , что особенно важно в условиях смешанных инвазий или при наличии разных популяций и позволяет существенно улучшить точность выявления H. glycines . Ген CLV3 , ассоциированный с белком семейства CLE , в данном исследовании играет ключевую роль в точной диагностике, анализе генетического разнообразия и разработке стратегий управления заболеваниями, вызванными цистообразующими нематодами.