Генетическая дифференциация на основании полиморфизма микросателлитных маркеров популяций тополя черного на Среднем и Южном Урале

Никоношина Наталья Алексеевна, студентка разнообразия популяций древесных видов растений, к которым относятся тополь чёрный (Populus nigra L.), играющий важнейшую роль при сохранении пойменных экосистем и используемый как источник древесины в промышленности и строительстве. Кроме этого, это вид относится в роду Populus L., который является модельным родом для изучения геномов древесных видов растений [2].

Тополь чёрный (Populus nigra L., Salicaceae) – анемофилльное, двудомное растение. Его пыльца и семена разносятся ветром на большие расстояния. Этим определяется передача генов и значительное генетическое разнообразие этого вида. Следовательно, выявление взаимосвязи между генетической дистанцией и географическим расстояния между популяциями на примере P. nigra является одним из важнейших аспектов в молекулярно-генетическом анализе дифференциации популяций древесных растений. Эта взаимосвязь является предметом пристального внимания и обсуждения, тем более, что такая корреляция установлена в Пермском крае у природных популяций тополя дрожащего [3], но является спорной при обсуждении результатов молекулярно-генетического анализа популяций P. nigra [4], так и других видов рода Populus [5-7]. Возможно, самым универсальным показателем генетической дистанции является генетическое расстояние, определенное по методу М. Нея [8] и показатель генетической дифференциации популяций С. Райта [9], так как именно они чаще всего используются в программах для компьютерного анализа генетических данных. Но рядом авторов для микросателлитых маркеров [10, 11], рекомендуется использовать и другие методы, а именно показатели Дж. Рейнольдса, Б. Вейра, С. Кокерхама [12], Л. Кавалли-Сфорца и А. Эдвардса [13]. Показатели генетической дифференциации популяций могут варьировать в зависимости от подхода их определения. Важным моментов является перечень условий, которые учитываются при кластеризации популяций, например, какая именно модель избрана для построения филогенетического дерева.

Цель работы: выявление генетической дифференциации на основании полиморфизма микросателлитных маркеров между четырьмя популяциями P. nigra Среднего и Южного Урала, анализ четырех методов определения генетической дифференциации и взаимосвязи генетического и географического расстояния между изученными популяциями P. nigra .

Материал и методика исследования. Объектами исследований являлись четыре популяции P. nigra из разных ботанико-географи-ческих районов Среднего и Южного Урала: первая популяция (Sp_1 или Спасская гора), расположенная в историко-природном комплексе «Спасская гора» в зоне островной Кунгурской лесостепи южной тайги Пермского края (Средний Урал); вторая популяция (B_2 или Бирск,) находится около г. Бирск Республики Башкортостан в лесостепном районе Южного Урала; третья популяция (St_3 или Стерлитамак), расположенная около г. Стерлитамак Республики Башкортостан в степном районе Южного Урала; четвертая популяция (In_4 или Инзер,) находится на территории Южно-Уральского заповедника в горном районе Южного Урала. Минимальное географическое расстояние между популяциями составило около 137 км (между St_3 и In_4), а максимальное – около 380 км (между Sp_1 и St_3).

Для молекулярно-генетического анализа P. nigra были собраны листья с 30-32 случайно избранных деревьев на расстоянии не менее 50 м друг от друга . Для выделения ДНК использовали модифицированную методику S.O. Rogers [14], в которой использовали в качестве детергента СТАВ+PVPP (цетилтриметиламониум бромид + поливинилполипирролидон). При выделении ДНК из листьев брали навеску по 100 мг. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 («Thermo Scientific», USA) и для ПЦР выравнивали до 10 нг/мкл.

Наиболее соответствующими поставленной нами задаче генетическими маркерами являются высокополиморфные микросателлитные локусы. Кроме возможности оценки популяционногенетических параметров, анализ нескольких по-лиаллельных микросателлитных локусов даёт возможность составить уникальный генетический портрет каждого дерева. Нами было избрано семь микросателлитных (SSR) локусов (ORNL214, PMGC14, wpms09, wpms20, wpms17, wpms14, wpms15) из базы данных микросателлитов Международного Консорциума по геномам тополей IPGC (International Populus Genome Consortium) SSR Resource и из двух статей [15, 16]. Все праймеры были уже проверенны как на других популяциях P . nigra (в Европе), так и на других видах тополя – P . trichocarpa , P . tremuloides .

ПЦР, фрагментный анализ и компьютерный анализ данных проведен в Федеральном научноисследовательском центре лесов, опасных природных явлений и ландшафта (Federal Research and Training Centre for Forests, Natural Hazards and Landscape, Department of Genetics, Austria), в отделе исследований генома под руководством доктора Б. Хейнце (Вена, Австрия). Для амплификации SSR-методом мы использовали следующую программу: предварительная денатурация 98°C, 3 мин.; первые десять циклов 95°С, 30 сек.; t отж. 58°С, 30 сек., каждый цикл уменьшая температуру на 1°С; 72°С, 30 сек.; в последующих двадцати девяти циклах 95°С, 30 сек.; t отж. 53°С, 30 сек.; 72°С, 30 сек. Последний цикл элонгации длился 4 мин при 72ºС. Фрагментный анализ произведен на секвенаторе GenomeLab GeXP производства Beckman Coulter (USA). Компьютерный анализ полученных данных произведен с помощью программного обеспечения GenomeLab GeXP [17]. Тест Мантела, предназначенный для выявления связей между генетической дифференциацией популяций и географическим расстоянием [18], а также расчёт показателя генетической дифференциации популяций С. Райта (Fst) (первый метод) проводился с помощью программы GenAlЕx 6.5 [19]. На базе программы GENDIST пакета программ PHYLIP v 3.695 [20], были рассчитаны генетические дистанции М. Нея (второй метод), Дж. Рейнольдса (третий метод) и Л. Кавалли-Сфорца (четвёртый метод). Кластеризация по методу невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA) и методу ближайшего соседа (Neighbor Joining Method)» проведена в модуле «Neighbor» того же пакета программ. Также в модулях «Kitsch» и «Fitch» пакета программ PHYLIP v. 3.695 проведена кластеризация по методу взвешенных наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша [21].

Визуализацию полученных дендрограмм проводили с помощью программы TREEVIEW [22]. Кластерный анализ исследуемых популяций P. nigra был проведен и с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 [23]. Эта программа использует методы Монте Карло по схеме марковской цепи (Markov Chain Monte Carlo, MCMC), что позволяет минимизировать неравновесие Харди-Вайнберга и неравенство по сцеплению локусов в кластерном анализе индивидов [24]. Количество кластеров (К) находилось в диапазоне от 1 до 12. Для визуализации результатов, их математического подтверждения методами Evanno [25] была использована веб-программа STRUCTURE Harvester [26]. Данная web-программа была использована для детекции подходящего количества кластеров путём их индивидуального перебора.

Таблица 1. Матрицы генетических расстояний между четырьмя популяциями P. nigra

1
B_2	0,000
In_4	0,288	0,000
Sp_1	0,703	1,081	0,000
St_3	0,101	0,167	0,786	0,000
2
B_2	0,000
In_4	0,288	0,000
Sp_1	0,707	1,086	0,000
St_3	0,101	0,168	0,790	0,000
3
B_2	0,000
In_4	0,094	0,000
Sp_1	0,266	0,339	0,000
St_3	0,036	0,084	0,288	0,000
4
B_2	0,000
In_4	0,142	0,000
Sp_1	0,165	0,247	0,000
St_3	0,047	0,064	0,160	0,000

Примечание: обозначения: 1. – генетическое расстояние по М. Нею, 2 – генетическое расстояние по Дж. Рейнольдсу, Б. Вейру и С. Кокерхаму, 3 – генетическое расстояние по Л. Кавалли-Сфорцу и А. Эдвардсу, 4 – по показателю генетической дифференциацию С. Райту; обозначения популяций: B_2 – «Бирск», In_4 – «Инзер», Sp_1 – «Спасская гора», St_3 – «Стерлитамак»

Экспериментальная часть и обсуждение результатов. При использовании каждого из четырех анализируемых подходов наибольшее генетическое расстояние установлено между популяциями P. nigra In_4 и Sp_1. Значение этого показателя при определении методом М. Нея составило 1,081, Дж. Рейнольдса – 1,086, Л. Кавалли-Сфорца – 0,339, С. Райта – 0,247 (табл. 1). Следует отметить, географическое расстояние между популяциями In_4 и Sp_1 составляет 369 км, что меньше, чем между самыми отдаленными популяциями St_3 и Sp_1 (380 км). Самое низкое генетическое расстояние при каждом из четырех анализируемых методов (табл. 1) установлено между популяциями B_2 и St_3 – 0,047, 0,101, 0,101 и 0,036 и определено соответственно первым, вторым, третьим и четвёртым методом. Эти популяции менее дифференцированы, потому что они произрастают в пойме одной реки – Белой. Между ними происходит обмен генами – распространение семян и вегетативных частей вниз по течению реки. Такую вариабельность значений генетического расстояния можно объяснить применением различных формул.

При построении филогенетических деревьев с использованием четырех анализируемых методов у дендрограмм различалась топология получившихся ветвей. Она была одинаковой при построении дендрограмм методом ближайшего соседа модуля «Neighbor» и методом наименьших квадратов по критерию Фитч-Марголиаша модуля «Fitch», но она отличалась от двух других при построении дендрограмм методом невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA) модуля «Neigh-bor» и методом наименьших квадратов по критерию Фитч-Марголиаша модуля «Kitsch» (рис. 1).

Полученные результаты можно объяснить различием в методах кластеризации. Метод ближайшего соседа модуля «Neighbor» и метод наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша модуля «Fitch» не используют так называемые «эволюционные часы» [27], то есть не учитывают скорость преобразования генотипа в эволюции вида, строят неукоренившееся филогенетическое дерево и используют аддитивную модель построения. Метод невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA) модуля «Neighbor» и метод наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша модуля «Kitsch» наоборот используют «эволюционные часы», строят укоренившееся дерево и используют ультраметриче-скую модель построения. Интересен тот факт, что ближе всех друг к другу в филогенетическом дереве находились популяции St_3 и In_4. Их близость, возможно, обуславливает преобладающий на территории республики Башкортостан юго-западный ветер [28], способствующий переносу пыльцы.

Рис. 1. Дендрограмма, построенная на матрице значений генетического расстояния:

по М. Нею с помощью четырёх методов: 1 – метод ближайшего соседа (Neighbor Joining Method)», 2 – метод невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA), 3 – метод взвешенных наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша в модуле «Fitch», 4 – метод взвешенных наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша в модуле «Kitsch; обозначения популяций: «Spass» – «Спасская гора», «Inzer» – «Инзер», «Sterl» -Стерлитамак, «Birsk» – «Бирск»

Дендрограммы с одинаковой топологией имеют различный масштаб длин ветвей. В качестве примера можно привести дендро-граммы (рис. 2), полученные на основании генетического расстояния по второму и четвёртому методам с помощью метода невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA). Метод наименьших квадратов по критерию В. Фитч-Марголиаша обоих модулей позволяет нам сравнить полученные дендрограммы по показателям суммы квадратов и среднего процента стандартного отклонения (табл. 2).

Наименьшие значения обоих показателей в обоих модулях, а, следовательно, и наименьший разброс полученных значений у параметра генетического расстояния отмечен в четвёртом методе, а наибольшие – в первом. Это свидетельствует о том, что топология и длина ветвей оптимальнее в случае с использованием параметра генетического расстояния, определенным четвёртым методом Л. Кавалли-Сфорца и А. Эдвардса. Во всех полученных дендрограммах наблюдалось обособление популяции Sp_1, иногда даже с очень длинной ветвью. Это также подтверждается результатом кластерного анализа, проведенного c помощью STRUCTURE 2.3.4 (рис. 3).

Рис. 2. Дендрограммы, полученные на основании генетического расстояния, определенного по методу М. Нея (1) и Л. Кавалли-Сфорца и А.Эдвардса (2) с помощью метода невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA); обозначения популяций: «Spass» – «Спасская гора», «Inzer» – «Инзер», «Sterl» – «Стерлитамак», «Birsk» – «Бирск»

Таблица 2. Сумма квадратов и средний процент стандартного отклонения по изученным показателям генетической дифференциации в модулях «Fitch» и «Kitsch»

Модуль/ показатель		Первый метод (по Райту)	Второй метод  (по М. Нею)	Третий метод (по Дж. Рейнольдсу)	Четвертый метод (по Л. Кавалли-Сфорцу)
«Fitch»	сумма квадратов	0,07703	0,02386	0,02386	0,00045
	средний процент стандартного отклонения	8,77661	4,88504	4,88504	0,66916
«Kitsch»	сумма квадратов	0,68400	0,43100	0,43100	0,07200
	средний процент стандартного отклонения	26,15798	20,75619	20,75619	8,45951

При выявлении корреляции между генетическим и географическим расстоянием с помощью теста Мантела получены высокие коэффициенты детерминации (R2), но они различны при анализируемых четырех методах. Тест Мантела, проведенный для каждого параметра генетической дифференциации, показал высокую корреляцию между значениями географического и генетического расстояния. Очень тесная корреляция наблю- далась также и у изученных ранее уральских популяций P.tremula ( r =0,9 [3]). Так, при использовании первого, второго, третьего и четвёртого методов значения коэффициента детерминации составляли 0,694, 0,787, 0,703 и 0,780 соответственно (рис. 4). Исследования тополей в Европе показали низкие показатели R2 у таких видов как P. tomentosa (R2 =0,007 [6]), P.tremuloides (R2=0,202 [7]), P.euphratica (R2=0,10 [5]), так и P.nigra (R2=0,07 [4]).

Примечание: по оси ординат – доля частот аллелей соответствующего кластера, по оси абсцисс – порядковый номер популяций, где 1– «Бирск», 2 – «Инзер», 3 – «Спасская гора», 4 – «Инзер»; тёмным (красным) цветом обозначен первый кластер (генотипы популяций из Республики Башкортостан), а светлым )зеле-ным) – второй (генотипы популяции Спасская гора из Пермского края)

Рис. 3. Кластерный анализ генотипов изученных популяций P. nigra Урала с помощью программы STRUCTURE

Выводы: установлено, что для определения генетической дифференциации изученных популяций P. nigra с использованием полиморфизма кодоминантных маркеров, таких как SSR-PCR маркеры, наиболее оптимальным является метод Л. Кавалли-Сфорца и А.Эдвардса . Тем не менее, общие закономерности генетической дифференциации сохраняются при каждом из четырех проанализированных методов. Доказана правильность кластеризации изученных популя-ций и высокая корреляция между генетическим и географическим расстоянием между популяциями, так как высок коэффициент детерминации (R²) показателя генетической дифференциации (0,694 по методу С.Райта, 0,787 по методу М.Нея). Эти данные совпадает с результатами, полученными при изучении семи популяций P. tremula Пермского края [3] на основании полиморфизма межмикросателлит-ных маркеров. При анализе в программе STRUCTURE 2.3.4 четыре популяции P.nigra разделились на 2 кластера: популяции из Республики Башкортостан и из Пермского края. Данные о генетической диф-ференциации популяций необходимы для оценки и сопоставления состояния генофондов древесных видов растений и создания программ сохранения генетических ресурсов.

Рис. 4. Зависимость между генетическим расстоянием по методу М.Нея и географическим расстоянием изученных четырех популяций P.nigra

Выражаем искреннюю благодарность Федеральному научно-исследовательскому центру лесов, опасных природных явлений и ландшафта, отделу исследований генома, Вена, Австрия (Federal Research and Training Centre for Forests, Natural Hazards and Landscape, Department of Genetics, Austria) и руководителю отдела геномики – доктору Бертольду Хайнце и сотруднице отдела Ренате Слански.

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект 144, № гос. рег.