Генетическая характеристика российской популяции немецких классических пони по STR-локусам и генам, влияющим на масть

Немецкий классический пони — сравнительно молодая порода, официальная регистрация которой состоялась в 2000 году. Порода создавалась в Германии на конном заводе семьи Grober с использованием шетлендских пони европейской селекции и более элегантных по типу американских классических пони. Родоначальником новой породы стал импортированный в Германию в 1965 году караковый жеребец по кличке Jiggs 1958 года рождения, имевший титул чемпиона США 1961 года. Немецкие классические пони умны, добронравны, энергичны, гармонично сложены и исключительно элегантны, имея рост в холке до 112 см, вы- глядят как верховая лошадь в миниатюре, идеально подходящая для детского конного спорта (1).

Один из ярких отличительных признаков породы — широкое распространение нарядной игреневой масти разнообразных оттенков. Игреневая масть у домашней лошади Equus caballus характеризуется специфическим ослаблением интенсивности пигментации покровных и защитных волос. А.С. Красников в 1957 году описывал две основных вариации игреневой масти у лошадей: темно-игреневую, характеризующуюся туловищем шоколадного цвета, часто в яблоках, с белым или дымчатым хвостом и гривой, и светло-игреневую, отличающуюся окраской туловища близкой к светло-коричневой (2, c. 246).

Игреневая масть считается редкой и не встречается в большинстве существующих конских пород, генетический механизм ее наследования изучался с 1950-х годов. В 1953 году американские исследователи W.E. Castle и F.H. Smith дали подробное описание оригинальных мастей silver dapple (серебристая в яблоко) и dappled chestnut (рыжая в яблоко), достаточно часто встречавшихся у шетлендских пони, разводимых в США. Они предположили, что эти фенотипы связаны с неким доминантным геном Silver (серебро) (3). В 1886 году Американским клубом шетлендских пони была зарегистрирована кобылка по кличке Trot, рожденная в США от родителей, привезенных из Великобритании, и имевшая уникальную масть, схожую с палевым окрасом олененка, при этом волосы гривы и хвоста были очень светлыми, почти белыми. Внук кобылы Trot — жеребец по кличке Chestnut, родившийся в 1897 году, стал очень популярным в США производителем. Принято считать, что Chestnut — прародитель всех современных американских пони, обладающих различными вариантами игреневой масти (4).

В 2006 году E. Brunberg c соавт. (5) и в 2007 году M. Reissman c со-авт. (6) в двух независимых исследованиях установили, что игреневая масть у домашней лошади ассоциирована с мутантным вариантом гена PMEL17 , локализованного на 6-й хромосоме. Действие мутантного аллеля, названного Silver, выражается в осветлении покровных и защитных волос за счет уменьшения количества черного пигмента эумеланина, при этом влияние на количество желтого пигмента феомеланина практически отсутствует (7). Эффект ослабления пигментации под действием мутантного аллеля наиболее заметен в длинных волосах гривы и хвоста (8). Согласно D.P. Sponen-berg с соавт. (9), масти носителей мутации демонстрируют обширную фенотипическую изменчивость от ярко выраженного до минимального воздействия доминантного аллеля Silver. По свидетельству ряда исследователей, идентификация мастей, определяемых геном Silver, зачастую бывает затруднена, особенно у молодых животных, при этом масть некоторых лошадей может быть описана как темно-бурая, рыжая с осветленной гривой и хвостом, соловая различных оттенков и т.д. (5, 10).

Вариабильность оттенков масти, наблюдаемая у носителей гена Silver, базируется главным образом на полиморфизме генов MC1R и ASIP (11). Ген MC1R, кодирующий меланокортиновый рецептор 1-го типа, имеет два основных аллеля: доминантный аллель дикого типа контролирует выработку черного пигмента эумеланина, мутантный рецессивный аллель в гомозиготном состоянии подавляет синтез эумеланина и обеспечивает синтез красно-желтого пигмента феомеланина, обусловливая тем самым рыжую масть (9, 10). В настоящее время известно, что рецессивная мутация у лошадей рыжей масти представляет собой однонуклеотидную замену C > T в гене MC1R (11). Ген ASIP, кодирующий агути-сигнальный белок, влияет на синтез и характер распределения эумеланина. Доминантный аллель дикого типа контролирует гнедую масть, значительно ограничивая синтез эумеланина. У гнедых лошадей черный пигмент может накапливается только в определенных местах: в волосах ног, гривы и хвоста. Рецессивная мутация гена ASIP, представляющая собой делецию размеро 11 п.н., не оказывает влияния на синтез и распределение эумеланина и в гомозиготном состоянии определяет вороную масть (12).

В ряде заводских и локальных пород лошадей, в том числе у шет-лендских пони, встречается мутантный вариант гена MATP , получивший название Cremello, который ослабляет пигментацию кожи и волос, действуя по типу неполного доминирования, осветляя в основном красножелтый пигмент феомеланин и определяя буланую, соловую и изабелло-вую масти (8, 9). Мутация Cremello представляет собой однонуклеотидную замену G > A в экзоне 2 гена MATP (13). В отличие от гена Cremello, мутантный ген Silver осветляет волосы за счет уменьшения количества черного пигмента эумеланина, практически не оказывая влияния на количество красно-желтого пигмента феомеланина (14).

С 2010 года немецких классических пони стали разводить в России (1). В настоящее время российская популяция немецких классических пони крайне малочисленна: на начало 2023 года насчитывалось 30 чистопородных кобыл, используемых в разведении, и 9 жеребцов-производителей. Производящий состав породы сосредоточен в одном племенном хозяйстве — КФХ «Кошелев В.В.» (Тверская обл.). Оригинальная и нарядная масть племенных пони считается одним из важнейших селекционируемых в породе признаков.

Для успешной селекционной работы в популяциях животных с ограниченным генофондом особую важность приобретает проблема поддержания генетического разнообразия. Для оценки параметров генетического разнообразия в популяциях широко используются высокополиморфные STR-маркеры (short tandem repeat) (15, 16). В начале 1990-х годов в научной литературе появились первые описания STR-маркеров у домашней лошади (17, 18). К настоящему времени анализ ДНК с использованием STR-маркеров признан одним из наиболее эффективных инструментов для проведения генетических экспертиз по индивидуальной идентификации и подтверждению достоверности происхождения племенных и спортивных лошадей, в практике коннозаводства тестирование применяется повсеместно в качестве обязательной процедуры при регистрации племенного поголовья (14, 19, 20).

В большинстве современных генетических лабораторий, как правило, используются стандартизированные коммерческие наборы реагентов для генотипирования лошадей (StockMarks® Kit for Horses, «Applied Bio-systems», США; COrDIS Horse, ООО «ГОРДИЗ», Россия), включающие 17 STR-маркеров (21-23).

В настоящей работе впервые дана характеристика генетической структуры российской популяции немецких классических пони с применением ДНК-маркеров.

Цель исследования состояла в оценке генетической вариабельности в популяции немецких классических пони с использованием 17 высокополиморфных STR-маркеров, а также в изучении полиморфизма генов MC1R , ASIP , PMEL17 и MATP , влияющих на пигментацию волос и имеющих важное селекционное значение.

Методика . Образцы волос были отобраны от 32 немецких классических пони, используемых в разведении в Российской Федерации (КФХ 1110

«Кошелев В.В.», Тверская обл. 2019 год).

ДНК выделяли из волосяных луковиц с помощью коммерческого набора реагентов ExtraGene™ DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Россия). Генотипирование по 17 STR-маркерам (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX3, VHL20) проводили с использованием набора реагентов для мультиплексного анализа COrDIS Horse (ООО «ГОРДИЗ», Россия) согласно рекомендациям производителя.

При генотипировании биологических образцов по маркерам генов, детерминирующих масть, применяли коммерческие наборы реагентов GenPak® PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Мутацию гена ASIP (делеция 11 п.н.) детектировали согласно S. Rieder с соавт. (12) с использованием опубликованных последовательностей праймеров (F: 5´-CTTTTGTCTCTCTTTGAAGCATTG-3´, R: 5´-GAGAAG-TCCAAGGCCTACCTTG-3´) с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 3 % агарозном геле.

Генотипирование по SNP-маркерам C > T в гене MC1R , G > A в экзоне 2 гена MATP и C > T в экзоне 11 гена PMEL17 проводили методом PCR-RFLP (polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism) с использованием праймеров, дизайн которых был выполнен с помощью программ Primer-BLAST (27): F: 5´-CTGCACTCACCCATGTAC-TA-3´, R: 5´-GCAAGATTGCCATCTCCAGC-3´ для MC1R ; F: 5´-CTGGGCC-ATAACCATCACCA-3´, R: 5´-TCCCTGTCTGGGGAGCTAAA-3´ для MATP ; F: 5´-CTGCCCTTGTCCATTGCTTAC-3´, R: 5´-GCAGCCAGTGGGTTCT-ACC-3´ для PMEL17 . Детекцию однонуклеотидных полиморфизмов в выделенных фрагментах ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции соответственно TaqI , TasI и HhaI с последующим разделением полученных фрагментов в 3 % агарозном геле.

Для обозначения аллелей в исследованных локусах была использована буквенная номенклатура согласно M. Reissmann (8): ген MC1R — аллели E (доминантный аллель дикого типа) и e (рецессивный мутантный аллель); ген ASIP — аллели A (доминантный аллель дикого типа) и a (рецессивный мутантный аллель); ген PMEL17 — аллели Z (доминантный мутантный аллель Silver) и z (рецессивный аллель дикого типа); ген MATP — аллели C (аллель дикого типа, неполное доминирование) и c^Cr (мутантный аллель Cremello).

Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Microsoft Excel. Рассчитывали частоту встречаемости аллелей, число наблюдаемых аллелей в каждом локусе (А), эффективное число аллелей (Ae), ожидаемую (H e ) и наблюдаемую (H o ) гетерозиготность, коэффициент инбридинга (F is ). Вычисляли средние значения ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Ðåçóëüòàòû. Анализ STR-профилей немецких классических пони показал достаточно высокую генетическую изменчивость. В целом у 32 животных в 17 локусах было обнаружено 94 аллеля (табл. 1). Число аллелей в каждом локусе варьировало от 3 до 8 при среднем значении 5,53±0,35, показатель наблюдаемой гетерозиготности (Ho), рассчитанный с учетом 16 аутосомных локусов, составил 0,7051±0,0434. Коэффициент популяционного инбридинга Fis в большинстве исследованных локусов имел отрицательное значение при среднем (отрицательном) значении -0,0686±0,0196, что свидетельствует о преобладании в популяции гетерозиготных генотипов. По показателям степени полиморфности и гетерозиготности российская популяция немецких классических пони несколько превосходила исследованные ранее L.H.P. Van de Goor с соавт. (23) популяции шетлендских пони, разводимых в странах Западной Европы. Следует отметить, что в связи с малочисленностью популяции немецких классических пони в России может быть полезным регулярное проведение мониторинга с использованием STR-локусов, рекомендованных в качестве эффективного инструмента при оценке параметров генетического разнообразия (24-26).

1. Показатели генетического разнообразия в популяции немецких классических пони по STR-локусам ( n = 32; КФХ «Кошелев В.В.», Тверская обл., 2019 год)

STR-локусы	Показатель
	A 1	A e	H e	H o	Fis
AHT4	8	5,13	0,8052	0,8750	-0,0867
AHT5	6	4,29	0,7671	0,7500	0,0223
ASB17	8	4,25	0,7646	0,8125	-0,0626
ASB2	6	4,03	0,7520	0,7500	0,0026
ASB23	4	3,72	0,7310	0,7188	0,0167
CA425	4	2,05	0,5122	0,5625	-0,0982
HMS1	4	1,77	0,4341	0,4688	-0,0799
HMS2	4	3,27	0,6938	0,7500	-0,0809
HMS3	5	2,14	0,5327	0,6250	-0,1732
HMS6	6	4,10	0,7559	0,8750	-0,1576
HMS7	7	5,15	0,8057	0,8750	-0,0861
HTG10	7	4,39	0,7725	0,7813	-0,0114
HTG4	6	2,66	0,6245	0,7500	-0,2009
HTG6	5	2,48	0,5962	0,5625	0,0565
HTG7	3	1,34	0,2515	0,2500	0,0058
LEX3	6	3,57
VHL20	5	4,02	0,7515	0,8750	-0,1644
M ±SEM	5,53±0,35	3,43±0,28	0,6594±0,0393	0,7051±0,0434	-0,0686±0,0196

Примечание. A — число наблюдаемых аллелей, A e — число эффективных аллелей, H e — ожидаемая гетерозиготность, H o — наблюдаемая гетерозиготность, F IS — коэффициент инбридинга. LEX3 локализован на Х-хромосоме, мужские особи гемизиготны, поэтому показатели гетерозиготности и FIS для этого локуса не вычисляли.

По результатам генотипирования по генам MC1R , ASIP и PMEL17 в каждом исследованном локусе было выделено по 3 генотипа: гомозиготный по доминантному аллелю, гомозиготный по рецессивному аллелю и гетерозиготный (рис. 1). По гену MATP все протестированные нами пони имели гомозиготный по дикому аллелю генотип C / C , мутация Cremello у животных экспериментальной выборки не обнаружена. Подавляющее число пони (31 гол.) были носителями доминантного аллеля E гена MC1R , контролирующего синтез меланоцитами черного пигмента эумеланина. Только один пони имел гомозиготный по рецессивному аллелю генотип e / e , ассоциированный с рыжей мастью.

Рис. 1. Частота встречаемости различных генотипов в генах ASIP , MC1R , MATP и PMEL17 у немецких классических пони (КФХ «Кошелев В.В.», Тверская обл., 2019 год) .

Рис. 2. Частота встречаемости аллельных вариантов генов MC1R , ASIP , PMEL17 и MATP в популяции немецких классических пони (КФХ «Кошелев В.В.», Тверская обл., 2019 год) .

Частота встречаемости доминантного аллеля E в популяции составила 0,688, частота встречаемости доминантного аллеля A гена ASIP — 0,313 (рис. 2). Носителями доминантного аллеля A были 15 животных, у 17 пони обнаружили гомозиготный по рецессивному аллелю генотип a/a. Большинство протестированных животных (28 пони) оказались носителями доминантного мутантного аллеля Z (Silver) гена PMEL17, в том числе 8 животных имели гомозиготный генотип Z/Z.

Частота встречаемости аллеля Z в производящем составе немецких классических пони, разводимых в России, составила 0,563 (рис. 2). Оче- видно, что оригинальные, осветленные по типу Silver масти служат одним из наиболее значимых селекционируемых в породе признаков.

2. Варианты генотипов немецких классических пони по полиморфизмам генов ASIP , MC1R , MATP и PMEL17 (КФХ «Кошелев В.В.», Тверская обл., 2019 год)

Генотипы	Число животных	Частота встречаемости в популяции
a/a-E/E-C/C-Z/Z	1	0,0313
a/a-E/E-C/C-Z/z	7	0,2188
a/a-E/e-C/C-Z/Z	3	0,0938
a/a-E/e-C/C-Z/z	4	0,1250
a/a-E/e-C/C-z/z	1	0,0313
A/A-E/E-C/C-Z/Z	1	0,0313
A/A-E/e-C/C-Z/z	2	0,0625
A/A-E/e-C/C-z/z	2	0,0625
A/a-E/E-C/C-Z/Z	1	0,0313
A/a-E/E-C/C-Z/z	3	0,0938
A/a-E/e-C/C-Z/Z	1	0,0313
A/a-E/e-C/C-Z/z	4	0,1250
A/a-E/e-C/C-z/z	1	0,0313
a/a-e/e-C/C-Z/Z	1	0,0313

В целом по четырем генам, детерминирующим пигментацию, у 32 животных экспериментальной выборки было идентифицировано 14 различных вариантов генотипа (табл. 2).

Масти исследованных нами пони характеризовались широкой фенотипической изменчивостью и разлной степенью влияния мутации Silver на изменение интенсивности пигментации покровных и защитных волос (рис. 3). При этом масти гомозиготных носителей доминантного аллеля Z (Silver) выделялись большей степенью осветления.

У пони с наиболее ти- пичными для исследованной популяции генотипами a/a-E/E-C/C-Z/z и a/a-E/e-C/C-Z/z цвет покровных волос туловища варьировал от серокоричневого (оттенок сепии) до интенсивно-шоколадного, наблюдалось наличие яблок, волосы гривы и хвоста были белыми или дымчатыми. У пони с генотипами a/a-E/E-C/C-Z/Z и a/a-E/e-C/C-Z/Z туловище серокоричневого цвета с ярко-выраженными яблоками, волосы гривы и хвоста белые. Животные с генотипами A/A-E/E-C/C-Z/Z и A/a-E/E-C/C-Z/Z характеризовались светло-рыжим цветом туловища, светлыми волосами гривы и хвоста, значительным осветлением волос в нижней части ног, в паху и в области подпруги; участки темной пигментации на ногах имели серокоричневый оттенок. Цвет волосяного покрова туловища у пони с генотипами A/A-E/e-C/C-Z/z, A/a-E/E-C/C-Z/z, A/a-E/e-C/C-Z/z варьировал от рыжего до темно-рыжего, волосы гривы и хвоста были осветлены в различной степени (рыжеватые, дымчатые или белые). Пони — носитель ге- нотипа A/a-E/e-C/C-Z/Z отличался серо-коричневым (оттенок сепии) цветом туловища, светлыми волосами гривы и хвоста, незначительным осветлением волос в нижней части ног. Пони с генотипом a/a-e/e-C/C-Z/Z имел рыжую масть с осветлениями в нижней части ног, в паху и в области подпруги. Животные с генотипами A/a-E/e-C/C-z/z и A/A-E/e-C/C-z/z имели гнедую масть. Масть пони с генотипом a/a-E/e-C/C-z/z выглядела как вороная «в загаре».

Рис. 3. Вариации мастей у немецких классических пони в зависимости от генотипа: a — A/A-E / E-Ñ / Ñ-Z / Z , б — a / a-E / e-Ñ / Ñ-Z / Z , в — A / a-E / E-Ñ / Ñ-Z / z , г — a / a-E / E-Ñ / Ñ-Z / Z , д — a/a-e / e-Ñ / Ñ-Z / Z , е — a / a-E / e-Ñ / Ñ-Z / z (КФХ «Кошелев В.В.», Тверская область, 2019 год).

Согласно D.P. Sponenberg с соавт. (9), группа мастей, основанных на ослаблении пигментации по типу Silver, получила широкое распространение в таких породах, как лошадь скалистых гор (Rocky Mountain Horse) и исладская лошадь. Однако вследствие плейотропного действия мутации Silver у ее носителей встречаются так называемые множественные врожденные аномалии глаз (multiple congenital ocular abnormalities), в наиболее тяжелых случаях у животных может наблюдаться снижение зрительных функций (9). Среди владельцев исландских лошадей существует мнение, что носители аллеля Silver более нервные и пугливые (4, 28). Исследовав на ограниченном числе животных различия в поведенческих реакциях исландских лошадей в зависимости от масти, E. Brunberg с соавт. (28) пришли к выводу, что носители мутации Silver более осторожны в новых ситуациях, при этом не отличаются от других лошадей большей реактивностью при испуге. Предрасположенность носителей аллеля Silver к наруше- ниям зрения должна учитываться заводчиками лошадей в селекционной работе (4).

Таким образом, исследование российской популяции немецких классических пони с использованием 17 STR-маркеров продемонстрировало наличие достаточно высокой внутрипородной генетической изменчивости: при среднем значении числа аллелей на локус, равном 5,53±0,35, показатель наблюдаемой гетерозиготности с учетом 16 аутосомных локусов составил 0,7051±0,0434. Отрицательное значение коэффициента популяционного инбридинга F is ( - 0,0686±0,0196) свидетельствует о преобладании в популяции гетерозиготных генотипов. Изучение полиморфизма генов MC1R , ASIP, PMEL17 и MATP, контролирующих пигментацию кожи и волос, показало, что частота встречаемости доминантного аллеля A гена ASIP и доминантного аллеля E гена MC1R составила соответственно 0,3125 и 0,6875. Частота встречаемости доминантного аллеля Z гена PMEL17 составила 0,5625. Мутация Cremello гена MATP у животных экспериментальной выборки не обнаружена. В исследованной популяции преобладали аллельные варианты генов MC1R и ASIP , детерминирующих синтез темного пигмента эумеланина, а также мутантного варианта гена PMEL17 , уменьшающего количество этого пигмента в волосах и осветляющего масть. У протестированных нами пони чаще встречались генотипы a / a-E/ E-C / C-Z / z , a / a-E/ e-C/ C-Z/ z , A / a-E / e-C/ C-Z / z , a / a-E/ e-C/ C-Z / Z , A / a-E/ E-C / C-Z / z , ассоциированные с наиболее необычными и нарядными мастями.