Генетическая модификация половых клеток петухов с использованием различных методических подходов

Половые клетки гонад самцов сельскохозяйственной птицы рассматриваются в качестве перспективных клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК с целью направленного внесения модификаций их генома. Наибольший интерес представляет модификация предшественников половых клеток и ранних половых клеток - примордиальных зародышевый клеток (ПЗК) и сперматогониев. В случае их трансплантации и успешной колонизации в гонадах реципиентов возможно получение значительной популяции трансформированных зрелых половых клеток (спермиев), которые могут быть использованы для осеменения самок и получения потомства с внесенными генетическими модификациями. Новизна настоящего исследования заключалась в разработке и оптимизации отдельных этапов локальной трансформации сперматогенных клеток петухов посредством трансфекции ПЗК эмбрионов и сперматогогенных клеток семенников на ранних стадиях дифференцировки. Нашей целью была оценка эффективности генетической трансформации половых клеток петухов с использованием различных методических подходов. Исследования выполняли на курах ( Gallus gallus domesticus ) породы русская белая. Примордиальные зародышевые клетки выделяли из 6-суточных эмбрионов. Трансформацию полученной культуры ПЗК осуществляли посредством электропорации с применением системы Neon («Thermo Fisher Scientific», США). Для трансфекции использовали плазмиду ZsGreen1-N1 («Addgene», США) с геном ZsGreen под CMV промотором. Трансформированные клетки в количестве 400, 700 и 1000 вводили в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов. Эмбрионам контрольной группы в дорсальную аорту вводили ростовую среду DMEM. Трансформацию сперматогенных клеток петухов in vivo осуществляли посредством введения лентивирусного вектора непосредственно в семенники однократно в возрасте 3 или 4 мес и двукратно - в 3 и 4 мес. Вирусный препарат в концентрации 1´107 КОЕ/мл вводили из расчета 0,5 мл на семенник. Лентивирусный вектор содержал репортерный ген ZsGreen под CMV промотором. Для оценки эффективности колонизации и развития донорских примордиальных зародышевых клеток в гонадах реципиентов, а также результативности трансформации сперматогенных клеток in vivo были получены и проанализированы гистологические срезы семенников опытных самцов. В качестве контроля использовали нетрансгенных петухов, подобранных по принципу аналогов (возраст, порода). Для оценки возможности получения трансгенного потомства отбирали петухов с донорскими (введение в эмбрионы донорских ПЗК) и собственными (введение в семенники вирусного препарата) трансформированными половыми клетками, которых далее использовали для осеменения самок. Оценивали оплодотворяющую способность семени опытных петухов и долю эмбрионов с экспрессией гена ZsGreen . Эффективность трансформации клеток-мишеней определяли по экспрессии репортерного гена ZsGreen с использованием микроскопа Nikon Ni-U («Nikon», Япония). Культура эмбриональных клеток кур, полученная на первом этапе эксперимента, состояла из нескольких типов клеток. Доля ПЗК не превышала 3 %. Посредством разделения разных типов эмбриональных клеток по адгезии удалось повысить количество ПЗК в клеточной суспензии до 81 %. Эффективность трансформации клеточной культуры ПЗК составила 12 %. Наличие флуоресцирующих сперматогенных клеток в канальцах семенников было установлено при введении как трансформированных донорских ПЗК, так и лентивирусного вектора. При введении донорских ПЗК в концентрации 400, 700 и 1000 клеток на эмбрион доля цыплят с трансформированными половыми клетками составила соответственно 16, 23 и 26 %. Наибольшая результативность трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo была установлена при двукратном введении вирусного препарата в возрасте 3 и 4 мес - 10 %. При однократном введении вирусного препарата этот показатель был 2 раза ниже. Результативность получения трансгенного потомства от особей с трансформированными половыми клетками составила 6