Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии в животноводстве. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья обзорная
Разработка технологий активного трансгенеза сделала возможным внесение направленных изменений (геномное редактирование, genome editing, GE) в геном сельскохозяйственных животных с относительно высокой результативностью (обзоры S.Y. Yum с соавт., 2018; A.L. Van Eenennaam, 2019; N.A. Zinovieva с соавт., 2019). Однако эффективное совершенствование систем производства продукции животноводства на основе GE-технологий требует разработки комплексного подхода, основанного на использовании методов биотехнологии, популяционной генетики, геномики количественных признаков и вспомогательных репродуктивных технологий (assisted reproductive technology, ART) (C. Rexroad с соавт., 2019). Развитие ART, включая получение генеративного материала для геномного редактирования от животных с желаемыми генетическими характеристиками, эффективное получение GE-потомства и как можно более раннее его тиражирование, - неотъемлемая составляющая успешного развития и внедрения геномных технологий в скотоводстве (A.L. Van Eenennaam, 2019). В настоящем обзоре проведен ретроспективный анализ развития вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе искусственного осеменения (R.H. Foote, 2002; R.G. Saacke, 2012; P. Lonergan, 2018), трансплантации эмбрионов (K.J. Betteridge, 2003; R.J. Mapletoft, 2013), производства эмбрионов in vitro (IVP, in vitro production) (L. Ferré с соавт., 2019), прижизненного получения ооцитов (Ovum-Pick-Up) (R. Boni, 2012; M. Qi с соавт., 2013), переноса ядер соматических клеток (C.L. Keefer, 2015; K.R. Bondioli, 2018; A.V. Lopukhov с соавт., 2019). Дана характеристика современного состояния исследований, дискутируются направления совершенствования ART в связи с применением генетических технологий в скотоводстве, включая генное редактирование. Показано, что за более чем 100-летнюю историю достигнут значительный прогресс в развитии вспомогательных репродуктивных технологий у крупного рогатого скота, многие из которых сегодня активно используются в практическом животноводстве (C. Smith, 1988; L. Ferré с соавт., 2019) и стали базисом для разработки эффективных программ генетического совершенствования скота, включая геномную селекцию (P.M. VanRaden с соавт., 2009). Современные приоритеты в исследованиях ориентированы на прогресс в селекции крупного рогатого скота посредством интеграции GE-технологий в программы разведения (C. Rexroad с соавт., 2019; A.L. Van Eenennaam, 2019). Вспомогательные репродуктивные технологии будут играть одну из определяющих ролей в решении этой амбициозной задачи.
Бесплатно
Генетическая модификация половых клеток петухов с использованием различных методических подходов
Статья научная
Половые клетки гонад самцов сельскохозяйственной птицы рассматриваются в качестве перспективных клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК с целью направленного внесения модификаций их генома. Наибольший интерес представляет модификация предшественников половых клеток и ранних половых клеток - примордиальных зародышевый клеток (ПЗК) и сперматогониев. В случае их трансплантации и успешной колонизации в гонадах реципиентов возможно получение значительной популяции трансформированных зрелых половых клеток (спермиев), которые могут быть использованы для осеменения самок и получения потомства с внесенными генетическими модификациями. Новизна настоящего исследования заключалась в разработке и оптимизации отдельных этапов локальной трансформации сперматогенных клеток петухов посредством трансфекции ПЗК эмбрионов и сперматогогенных клеток семенников на ранних стадиях дифференцировки. Нашей целью была оценка эффективности генетической трансформации половых клеток петухов с использованием различных методических подходов. Исследования выполняли на курах ( Gallus gallus domesticus ) породы русская белая. Примордиальные зародышевые клетки выделяли из 6-суточных эмбрионов. Трансформацию полученной культуры ПЗК осуществляли посредством электропорации с применением системы Neon («Thermo Fisher Scientific», США). Для трансфекции использовали плазмиду ZsGreen1-N1 («Addgene», США) с геном ZsGreen под CMV промотором. Трансформированные клетки в количестве 400, 700 и 1000 вводили в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов. Эмбрионам контрольной группы в дорсальную аорту вводили ростовую среду DMEM. Трансформацию сперматогенных клеток петухов in vivo осуществляли посредством введения лентивирусного вектора непосредственно в семенники однократно в возрасте 3 или 4 мес и двукратно - в 3 и 4 мес. Вирусный препарат в концентрации 1´107 КОЕ/мл вводили из расчета 0,5 мл на семенник. Лентивирусный вектор содержал репортерный ген ZsGreen под CMV промотором. Для оценки эффективности колонизации и развития донорских примордиальных зародышевых клеток в гонадах реципиентов, а также результативности трансформации сперматогенных клеток in vivo были получены и проанализированы гистологические срезы семенников опытных самцов. В качестве контроля использовали нетрансгенных петухов, подобранных по принципу аналогов (возраст, порода). Для оценки возможности получения трансгенного потомства отбирали петухов с донорскими (введение в эмбрионы донорских ПЗК) и собственными (введение в семенники вирусного препарата) трансформированными половыми клетками, которых далее использовали для осеменения самок. Оценивали оплодотворяющую способность семени опытных петухов и долю эмбрионов с экспрессией гена ZsGreen . Эффективность трансформации клеток-мишеней определяли по экспрессии репортерного гена ZsGreen с использованием микроскопа Nikon Ni-U («Nikon», Япония). Культура эмбриональных клеток кур, полученная на первом этапе эксперимента, состояла из нескольких типов клеток. Доля ПЗК не превышала 3 %. Посредством разделения разных типов эмбриональных клеток по адгезии удалось повысить количество ПЗК в клеточной суспензии до 81 %. Эффективность трансформации клеточной культуры ПЗК составила 12 %. Наличие флуоресцирующих сперматогенных клеток в канальцах семенников было установлено при введении как трансформированных донорских ПЗК, так и лентивирусного вектора. При введении донорских ПЗК в концентрации 400, 700 и 1000 клеток на эмбрион доля цыплят с трансформированными половыми клетками составила соответственно 16, 23 и 26 %. Наибольшая результативность трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo была установлена при двукратном введении вирусного препарата в возрасте 3 и 4 мес - 10 %. При однократном введении вирусного препарата этот показатель был 2 раза ниже. Результативность получения трансгенного потомства от особей с трансформированными половыми клетками составила 6
Бесплатно
Статья научная
Зааненская порода коз ценится за высокую молочную продуктивность и хорошие адаптационные качества, которые способствовали ее широкому распространению в мире за пределами Швейцарии. В России зааненская порода официально рекомендована к разведению и имеет племенной статус. Разведение в локальных условиях окружающей среды, а также региональные особенности используемых селекционных стратегий могут приводить к существенному изменению аллелофонда пород, в связи с чем актуально проведение геномных исследований национальных популяций мировых пород с целью установления их современного генетического статуса. В настоящей работе впервые представлены данные полногеномного анализа российской популяции коз зааненской породы, для которой была проведена сравнительная оценка с оригинальным (Швейцария) и мировым генофондом зааненской породы, представленным четырьмя странами. Нашей целью было рассмотрение генетического разнообразия и установление структуры российской популяции зааненской породы в аспекте генофонда коз этой породы из пяти различных стран (Швейцария, Франция, Италия, Аргентина и Танзания), полногеномные SNP-профили которых были получены из базы данных проекта AdaptMap. Исследования проводили на козах ( Capra hircus ) зааненской породы ( n = 21, RUS), разводимых в одном из племенных репродукторов на территории Российской Федерации, в 2019-2020 годах. ДНК выделяли из отобранных фрагментов ушной раковины с помощью наборов ДНК-Экстран-2 (ЗАО «Синтол», Россия). Генотипирование осуществляли с использованием ДНК-чипа GoatSNP50 BeadChip («Illumina, Inc.», США), содержащего 53347 SNPs и обеспечивающего покрытие среднего интервала между SNP в размере 40 кб. Для оценки генетического разнообразия и сравнительного анализа российской популяции коз с генофондом коз этой породы из пяти различных стран использовали SNP-профили зааненских коз, разводимых в Швейцарии (SWI, n = 38), Италии (ITA, n = 22), Франции (FRA, n = 55), Аргентине (ARG, n = 11) и Танзании (TNZ, n = 8), которые были получены из публично доступного хранилища цифровых данных Dryad и сгенерированы в рамках проекта AdaptMap. В качестве образца оригинального генофонда была выбрана швейцарская популяция зааненской породы. Биоинформационную обработку и визуализацию данных полногеномного генотипирования проводили в программах PLINK 1.90, Admixture 1.3, SplitsTree 4.14.5, в пакетах R «diveRsity» и «pophelper». Наблюдаемая гетерозиготность варьировала от 0,381 у SWI до 0,423 у FRA и была высокой у RUS (Ho = 0,418). В популяциях SWI, ITA, FRA значения коэффициента инбридинга оказались близки к нулю; у RUS, ARG и TNZ был отмечен дефицит гетерозигот - соответственно 1,5; 8,9 и 6,0 %. Аллельное разнообразие было максимальным у ARG, RUS и FRA (Ar ³ 1,979) и минимальным - у SWI (Ar = 1,934). Анализ главных компонент и структура филогенетического дерева показали четкую дифференциацию между национальными и оригинальной популяциями зааненской породы. Анализ популяционной структуры подтвердил сохранение генетической составляющей кластера SWI у коз группы RUS. У RUS наблюдались наименьшие генетические дистанции с FRA (FST = 0,02; RST = 0,189) и ITA (FST = 0,023; RST = 0,215); наибольшая дифференциация RUS была выявлена с TNZ (FST = 0,054; RST = 0,311) и SWI (FST = 0,06; RST = 0,276). Таким образом, различные стратегии селекции привели к генетическим различиям между национальными популяциями коз зааненской породы, при этом российская популяция коз сохраняет в себе геномные компоненты исходного генофонда.
Бесплатно
Статья научная
Известно, что пробиотические и пребиотические препараты улучшают функционирование кишечника и нормализуют процессы переваривания корма у животных. Колонизация желудочно-кишечного тракта полезной микрофлорой способствует снижению отрицательного влияния патогенных или условно-патогенных микроорганизмов, поддержанию оптимальной кислотности среды, профилактике дисбиоза, стимуляции факторов местного и общего иммунитета. Однако биологические механизмы реализации подобных свойств этих препаратов все еще окончательно не выяснены. Мы оценили воздействие двух российских препаратов - многофункциональной кормовой добавки комплексного действия Профорт® (ООО «Биотроф», Россия), сочетающей качества фермента и пробиотика, и пребиотика Ветелакт («НВЦ Агроветзащита», Россия) на количественный и качественный состав микробиоты кишечника у яичных кур, впервые сопоставив их эффекты с экспрессией генов b-дефензина 9 ( AvBD9 ), интерлейкина 8 ( IL8 ), галлинацина-10 ( Gal-10 ) и проэнкефалина ( PENK ), которые связаны с защитными системами организма. В опытах использовали три группы кур (по 20 гол.) кросса Ломанн белый ЛСЛ (Lohmann LSL) с интенсивностью яйцекладки в возрасте 25 нед не менее 95 % (условия вивария, 2019 год). Кормление птицы осуществляли комбикормом, составленным с учетом требований паспорта на кросс. Введение в рацион опытных групп указанных биологически активных добавок проводили ежедневно в течение 28 сут. Ежесуточно учитывали яйценоскость, еженедельно рассчитывали интенсивность яйцекладки, определяли массу яиц и живую массу птицы. После окончания опыта при помощи NGS секвенирования был определен состав микробиоты слепых отростков кишечника и проведена оценка экспрессии генов b-дефензина 9 ( AvBD9 ), интерлейкина 8 ( IL8 ), галлинацина-10 ( Gal-10 ) и проэнкефалина ( PENK ). Известно, что b-дефензин 9 и галлинацин-10 относятся к семейству эндогенных пептидов, которые представляют собой важный элемент системы врожденного иммунитета и связующее звено между врожденным (неспецифическим) и приобретенным (адаптивным, специфическим) иммунитетом, проэнкефалин - один из шести опиоидных пептидов, которые регулируют передачу сигналов между клетками и влияют на многие биологические процессы у позвоночных, включая развитие, рост и размножение, а интерлейкин 8 - один из основных провоспалительных хемокинов, образуемый макрофагами, эпителиальными и эндотелиальными клетками, который также играет важную роль в системе врожденного иммунитета. Экспериментально установлено, что наибольшие показатели яичной продуктивности (на 3,33 % выше контроля, р 0,05), при этом живая масса кур превышала контроль на 0,9 % (р > 0,05). Скармливание пребиотика способствовало увеличению общего числа микроорганизмов в содержимом кишечника до 7,625±0,74 lg КОЕ/г (микробное число в контроле составляло 7,598±1,01 lg КОЕ/г), тогда как пробиотик снижал количество микроорганизмов до 7,565±0,56 lg КОЕ/г (р > 0,05). При этом обе кормовые добавки способствовали увеличению числа бифидо- и целлюлозолитических бактерий в кишечнике и снижали общее количество патогенной и нежелательной микрофлоры на 25-50 %. Уменьшение в составе микробиоты доли патогенных и нежелательных микроорганизмов закономерно снижало потребность организма в факторах неспецифической защиты и провоспалительных цитокинах. У получавших кормовые добавки птиц экспрессия гена b-дефензина 9 была ниже в 3,3-5,0 раза, гена интерлейкина 8 - на 8-36 % по сравнению c контролем. Наряду со снижением экспрессии генов b-дефензина 9 и интерлейкина 8 было установлено повышение экспрессии гена галлинацина-10 в 1,48-1,55 раза и проэнкефалина в 1,11-1,91 раза, что, вероятно, связано с усилением защитных функций организма. Избирательное влияние пробиотика и пребиотика на репродукцию различных видов бактерий в кишечнике, подтвержденное экспрессией генов, связанных с иммунитетом, обосновывает перспективность применения изученных препаратов для повышения резистентности организма птицы и оптимизации функций иммунной системы без ущерба для продуктивности.
Бесплатно
Статья научная
Для рационального использования накапливаемой информации племенного учета в стадах молочного скота требуется создание эталонных, или референтных, групп животных, имеющих высокую достоверность оценки племенной ценности. Это необходимо при генетической оценке, а также при геномной селекции. Однако без качественного фенотипирования создание таких групп невозможно. Нужны данные о геномной вариабельности признаков фенотипа у животных разных генераций с использованием результатов полногеномного анализа (genome-wide association study, GWAS) и паттернов гомозиготности (runs of homozygosity, ROH). Высокопродуктивное стадо голштинизированного черно-пестрого скота Урала представляет собой релевантный объект как для модельных исследований, так и для пополнения референтной популяции скота России. Новизна выполненной нами работы заключается в оценке динамики изменчивости геномного инбридинга (FROH) в поколениях животных (мать матери-мать-дочь) и его сопоставлении с непосредственной геномной племенной ценностью (direct genomic values, DGV), а также в поиске новых механизмов подтверждения научной гипотезы об использовании ограниченного набора экспериментальных данных в GWAS. Объектом исследований были 76 коров и телок голштинизированной черно-пестрой породы, а также 9 голштинских быков-производителей, генотипированных примерно по 139 тыс. SNP (single nucleotide polymorphism) на платформе Bovine GGP HD («Illumina/Neogen», США). Для расчета DGV по выборке животных использовалась российская референтная группа скота (591 гол.). GWAS и ROH анализы проведены на основе 110448 SNP. Достоверность (p-values) полногеномных ассоциаций с прямыми фенотипами коров колебалась от 2,31½10-5 до 1,08½10-7. Обнаружены локусы количественных признаков на аутосомах BTA1, BTA2, BTA5, BTA7, BTA8, BTA10, BTA11, BTA12, BTA14, BTA16, BTA20, BTA21 и BTA26. Для величины удоя детектирован регион на BTA14 (1,44-1,59 Mb) с генами ZNF16 , ARHGAP39 и ZNF7 , сопряженными с повышенным выходом молочного жира. Для числа осеменений выявлен ряд SNP, локализованных в генах ( ARHGAP31 ) либо в непосредственной близости от них ( SERPINA5 ) и связанных с интенсивностью развития до половозрелого состояния, а также овариальной функцией у животных. Приведена характеристика ROH в зависимости от длины их фрагментов в геноме. Определены консервативные гомозиготные участки на хромосомах BTA12, BTA14, BTA26 и BTA29 с входящими в них наиболее значимыми генами, которые потенциально связаны с давлением отбора в исследуемой популяции преимущественно по признакам молочной продуктивности, репродукции и качественным параметрам оценки вымени. Величина FROH достоверно (р ROH = 0,135) отмечены для быков-отцов коров (поколение матерей) и телок (поколение дочерей). Каждая последующая генерация особей показывала среднее увеличение DGV по удою на +94,2 кг, по количеству молочного жира на +4,4 кг и белка - на +3,0 кг, что достаточно четко отражает стратегию на улучшение признаков молочной продуктивности в стаде при получении новых генотипов скота. Таким образом, показано, что на основе поиска ассоциаций и локусов, находящихся под селекционным давлением, можно оценить изменчивость прямых фенотипов крупного рогатого скота, используя ее как модель для исследований геномной вариабельности в отдельно взятом стаде.
Бесплатно
Поиск "отпечатков отбора" у домашних свиней и дикого кабана (обзор)
Статья обзорная
Свинья относится к одному из немногих видов, у которых имеются ныне живущие дикие предки, что предоставляет уникальную возможность для отслеживания эволюционной истории млекопитающих и определения «отпечатков отбора», обусловленных как одомашниванием, так и естественным отбором (K. Chen с соавт., 2007). Отбор приводит к модификациям в определенных областях генома, связанных с экономически значимыми признаками, адаптацией к климатическим и стрессовым условиям, иммунным ответом и устойчивостью к болезням. В результате давления отбора в геноме животных образуются изменения (S.R. Keller и соавт., 2008), известные как «отпечатки отбора» (M. Kreitman, 2000). Цель представленного обзора заключается в описании подходов, разработанных для идентификации «отпечатков отбора», а также в анализе обнаруженных следов селекции у домашних свиней и дикого кабана. С развитием современных методов полногеномных исследований значительно расширился арсенал средств, позволяющих проводить поиск регионов, которые подвергались давлению отбора. Анализ данных, полученных при полногеномном ресеквенировании (C.-J. Rubin с соавт., 2012; X. Li с соавт., 2017), полногеномном генотипировании на биочипах различной плотности (M. Huang с соавт., 2020; M. Muñoz с соавт., 2019), методами RADseq (Y. Li с соавт., 2017), RNA-seq (M. Li и соавт., 2017; Y. Yang и соавт., 2018), GBS (Y. Ma и соавт., 2018; K. Wang и соавт., 2018), используется для поиска «отпечатков отбора» у Sus scrofa . Проводится сканирование генома на наличие областей гомозиготности, а также оценка различий частоты аллелей или гаплотипов между популяциями или поколениями внутри популяции. Наиболее часто для идентификации «отпечатков отбора» применяют такие статистические методы, как анализ расширенной гаплотипической гомозиготности (EHH) (P.C. Sabeti с соавт., 2002), интегрированная оценка гаплотипов (iHS) (B.F. Voight с соавт., 2006), определение протяженных гомозиготных сегментов (ROH) (J. Gibson с соавт., 2006), индекса фиксации FST (R.C. Lewontin, J. Krakauer, 1973), анализ на основе гаплотипов (hapFLK) (M.I. Fariello с соавт., 2013), метод составных сигналов отбора (CSS) (I.A. Randhawa с соавт., 2014), и их сочетание. Селекционные модели у пород свиней различаются в зависимости от их эволюции и истории размножения, поэтому изучение «отпечатков отбора» у большого числа различных пород поможет лучше понять генетические вариации, лежащие в основе интересующих признаков. Так, широкомасштабные сканирования отпечатков диверсифицирующего отбора были успешно применены к домашним свиньям. В большинстве случаев изучались эволюционные и селекционные механизмы, обусловливающие изменения генома у китайских свиней (X. Li с соавт., 2017; M. Chen с соавт., 2018). Были обнаружены геномные регионы, способствующие адаптации к различным климатическим условиям (R.J. Cesconeto с соавт., 2017), а также гены-кандидаты, связанные с ростом, развитием (K. Wang с соавт., 2018), репродуктивными признаками (Z. Zhang с соавт., 2018) и некоторыми аспектами иммунного ответа (S. Yang с соавт., 2014). Полногеномные исследования отечественных ресурсов (A. Traspov с соавт., 2016) показали, что популяции свиней, разводимых на территории Российской Федерации, в том числе локальные, обладают собственной уникальной структурой - даже несмотря на то, что они возникли с участием иностранных импортированных пород. Это может быть связано с несколькими факторами, в том числе с различиями в происхождении, длительным периодом генетической изоляции, а также с особенностями климата и кормовой базы. Тем не менее в отечественном свиноводстве племенные ресурсы пока что остаются малоизученными. Таким образом, предлагаемые подходы, предназначенные для идентификации «отпечатков отбора», у свиней, разводимых на территории Российской Федерации, и кабана могут быть использованы для поиска и анализа следов селекции у этих животных.
Бесплатно
Поиск геномных областей, несущих летальные рецессивные варианты у свиней породы Дюрок
Статья научная
Эмбриональные потери у свиней достигают 30 %, и необходимость их снижения не вызывает сомнений. В качестве одного из генетических факторов, обусловливающих эмбриональную смертность, рассматриваются LoF (loss of function) мутации, которые в гомозиготном состоянии приводят к терминации синтеза белка или синтезу нефункциональных белков. Если у крупного рогатого скота проводится интенсивный поиск LoF мутаций, то у свиней такие исследования носят менее масштабный характер. Полногеномные методы анализа с использованием SNP (single nucleotide polymorphism) чипов средней и высокой плотности, равномерно охватывающих весь геном, позволяют применять новые подходы для идентификации позиционных кандидатов для летальных рецессивных аллелей. Один из таких подходов - анализ степени неравновесия по сцеплению (LD) аллелей SNP маркеров. В представленной работе с использованием анализа степени неравновесия по сцеплению мы впервые провели поиск областей в геноме, которые могут быть связаны с летальными рецессивными эффектами у свиней породы дюрок, и выявили ряд наиболее значимых однонуклеотидных полиморфизмов, локализованных в пределах генов и играющих важную роль в различных физиологических процессах. Нашей целью был поиск областей, несущих презумптивно летальные рецессивные варианты у свиней ( Sus scrofa ) породы дюрок, на основании анализа неравновесия по сцеплению аллелей в SNP локусах. Исследования проводили на 715 хрячках (ООО «Селекционно-гибридный центр», Воронежская обл.) в 2017-2019 годах. Полногеномное генотипирование осуществляли с использованием ДНК-чипов Porcine GGP HD («Neogene/Illumina, Inc.», США), содержащих около 70 тыс. SNP. По результатам контроля качества для анализа был отобран 42981 полиморфный SNP. Поиск референтных последовательностей (reference sequence, rs) и уточнение их локализации проводили в базе данных Ensembl (http://www.ensembl.org). Функциональные аннотации генов выполняли с использованием базы данных GeneCards (http://www.genecards.org). Анализ сохранения генетического равновесия показал наличие 990 SNP с отсутствием одного из гомозиготных генотипов (2,30 % от общего числа полиморфных SNP), которые были распределены между всеми хромосомами свиней, в том числе 205 SNP, находившихся в неравновесии по сцеплению (0,48 %). Наибольшей долей SNP, которые находились в неравновесии по сцеплению, характеризовались хромосомы SSC9 (0,85 %), SSC5 (0,77 %), SSC7 (0,68 %) и SSC2 (0,68 %), наименьшей - хромосомы SSC13 (0,28 %), SSC4 (0,29 %) и SSC10 (0,30 %). Для 52 SNP, 25 из которых были локализованы внутри генов, различия в частоте наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности оказались статистически значимы (p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }
Бесплатно
Статья научная
Технология получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота имеет широкие перспективы применения для решения задач, направленных на тиражирование высокопродуктивных и уникальных генотипов в племенном животноводстве, а также создание новых генотипов методами геномного редактирования. Известно, что основой успешного клонирования является способность донорского ядра соматической клетки перепрограммироваться в направлении тотипотентного состояния и что соответствующие трансформации ядра клетки (кариопласта) опосредуются факторами цитоплазмы ооцита (цитопласта) и начинаются с момента их объединения (слияния). При этом характер воздействия цитоплазмы зависит от многих факторов и является объектом направленного воздействия. В этой связи в рамках представляемой работы была поставлена цель оценить эффективность клонирования с точки зрения продолжительности воздействия цитоплазмы ооцита на донорское ядро до активации, возраста MII ооцитов на момент их активации в составе слившихся комплексов (цитогибридов), а также повторного электрослияния цитопласта и кариопласта. Изучали воздействие указанных факторов на формирование клонированных эмбрионов и их развитие до стадии бластоцисты. Выделенные post mortem ооцит-ку-мулюсные комплексы (ОКК) созревали в среде ТС-199, дополненной 10 % фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего (ФСГ) и 10 мкг/мл лютеинизирующего (ЛГ) гормонов. Через 20-24 ч созревания ОКК обрабатывали 0,1 % раствором гиалуронидазы, механически удаляли кумулюсные клетки и отбирали ооциты с первым полярным тельцем. Фетальные фибробласты (длительного срока хранения) культивировали до сформированного монослоя, контактно ингибировали в течение 2 сут и готовили к процедуре переноса в энуклеированный ооцит в виде суспензии. Для объединения ооцитов и перенесенных в их перивителлиновое пространство клеток применяли два последовательных прямоугольных импульса постоянного тока при напряжении 35 В продолжительностью 20 мкс (однократно или в случае отсутствия признаков объединения клеток двукратно). Полученные цитогибриды активировали иономицином через 1,0 или 2,0 ч после слияния (23-25 или 26-28 ч с момента начала созревания ооцитов-реципиентов) и культивировали до стадии бластоцисты. Доля раздробившихся ооцитов не различалась между экспериментальными группами и варьировала от 60,7 до 70,4 %. Также не различалась доля развития бластоцист, когда использовалось однократное или двукратное слияние (соответственно 29,4±4,4 и 22,8±3,5 %). При интервале между слиянием и активацией 1,0 ч выход бластоцист составлял 17,4±2,6 %. Удлинение продолжительности указанного периода до 2,0 ч повышало этот показатель до 31,1±3,8 % (p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }
Бесплатно
Статья научная
Энтерококкоз птиц - заболевание, которое проявляется поражением органов опорно-двигательной системы и сопровождается хромотой, атаксией, спондилитом, некрозом головки бедренной кости, бактериальным хондронекрозом. Его превалирующий возбудитель на территории Российской Федерации - бактерия Enterococcus cecorum (EC). Заболевание может возникать среди ремонтного молодняка (преимущественно петушков) в возрасте 1-7 нед, товарных бройлеров в возрасте 3-5 нед и у родительского поголовья в период пика продуктивности. В настоящей работе на основании результатов изучения патогенных, антигенных и иммуногенных свойств культур Enterococcus cecorum впервые разработана и апробирована отечественная вакцина против энтерококкоза. В условиях промышленного птицеводческого предприятия было доказано, что разработанное средство безвредно для птицы различных возрастных групп и обладает необходимой протективной эффективностью. Цель исследования - разработка средства специфической профилактики энтерококкоза сельскохозяйственной птицы и оценка эффективности полученного препарата. При изучении эпизоотической обстановки по энтерококкозу птицы в 2017-2018 годах на территории Российской Федерации было установлено неблагополучие на 11 птицеводческих предприятиях в Белгородской, Владимирской, Ярославской, Калужской, Челябинской, Тверской и Пензенской областях, а также в Республиках Мари-Эл и Удмуртия. Всего исследовали 647 проб паренхиматозных органов и тканей, полученных от птицы кросса Cobb 500 с типичным клинико-морфологическим проявлением энтерококкоза. Штаммы E. cecorum №№ 414, 425, 426, 837, 838, 839, 1096, 1481, 1517, 1647, 1865 выделили при комплексной бактериологической диагностике секционного материала. Установлено, что 72,73 % энтерококков были резистентны к ампициллину и пенициллину, 45,45 % - к ванкомицину, 27,27 % - к левофлоксацину, линезолиду, тетрациклину, 18,18 % - к норфлоксацину, рифампицину, хлорамфениколу и ципрофлоксацину, 9,09 % - к доксициклину. Наибольшее число культур оказались чувствительны к гентамицину и левофлоксацину (72,73 %), а также к доксициклину, линезолиду, рифампицину и хлорамфениколу (54,55 %). Все изученные штаммы вызывали гибель 100 % лабораторных белых мышей в течение 24-96 ч после внутрибрюшинного инфицирования. LD50 культур энтерококков составляла 1,7×107-9,4×108 мкр кл. При определении антигенных свойств культур в реакции агглютинации было установлено, что они гомологичны друг к другу, то есть относятся к одному серотипу. Определение количества антител у белых мышей, 2-кратно иммунизированных вакцинами из штаммов № 414 и № 1517, показало, что они обладают наибольшей антигенностью, индуцируя иммунитет (титр специфических антител 1:26,66±9,23), в то время как антигенность других штаммов была ниже (титр антител 1:21,33±9,23 и менее). На основании этого результата штаммы № 414 и № 1517 в последующем использовались как контрольно-производственные. Оценка иммуногенной активности экспериментального препарата на белых мышах показала, что вакцинация обеспечивала сохранность 90 % инфицированных животных, тогда как смертность в контроле составила 100 %. Для обеспечения высокой эффективности разрабатываемого средства необходимо введение 1,5 млрд мкр кл. EС, при этом оптимальный объем однократной дозы равен 0,2 см3. В качестве инактиванта при получении вакцинного препарата использовался формалин (0,3 %), в качестве адъюванта - полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ-6000) из расчета 10 % от объема. Разбавителем служил фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), значение pH вакцины регулировали с помощью 20 % раствора едкого натра до 7,2. Вакцина вызывала формирование иммунитета через 12-14 сут после 2-кратного внутримышечного введения, который сохранялся не менее 4 мес. При проведении клинических испытаний на курах кросса Cobb 500 была установлена безвредность и высокая специфическая эффективность вакцины для птицы. Двукратная вакцинация ремонтного молодняка обеспечивала повышение однородности стада на 4,6 % и снижение общего отхода на 0,13 %. Анализ производственных показателей вакцинированных кур-несушек показал снижение общего отхода на 1,81 % и повышение яичной продуктивности на 1,7 %. После первой вакцинации родительского поголовья титр антител у птицы составил в среднем 1:5,60±2,00 (n = 25), а через 14 сут после второй вакцинации он увеличивался до 1:43,52±15,67, что превышало значение защитного титра антител (1:26,66±9,23). Полученные результаты позволяют обсуждать возможность практического использования разрабатываемого средства на основе штаммов Enterococcus cecorum .
Бесплатно
