Генетическая регуляция активности калиевых каналов типа Kir в различных отделах мозга при формировании пространственной памяти у половозрелых крыс

Изучение генетической регуляции процессов формирования пространственной памяти является одним из актуальных вопросов в изучении интегративной деятельности мозга. Ранее нами были обнаружены новые закономерности генетической регуляции в мозге взрослых животных процессов нейрогенеза, нейроапоптоза и Notch - сигнальной трансдукции. Несомненный интерес вызывает также регуляция активности генов, продукты которых являются составной частью калиевых каналов (К+-каналы). Известно, что К+-каналы играют заметную роль в процессах формирования памяти, в том числе и пространственной памяти. На различных модельных системах показано, что К+-ток поверхностной мембраны снижается при обучении. Известно, что применение антагонистов К+-каналов способствует обучению и сохранению памятных следов. В электрофизических экспериментах ранее было обнаружено, что антагонисты К+-каналов индуцируют длительную потенциацию синаптической передачи, а также усиливают посттетаническую потенциацию. Было обнаружено, что дисфункция К+-каналов играет важную роль в механизмах развития ряда нарушений процессов памяти при заболеваниях нервной системы. В данном аспекте, исследования К+-каналов внутреннего выпрямления (Kir_каналы) и регуляции их активности на уровне генома практически отсутствуют. Основной ролью Kir - каналов является восстановление мембранного потенциала покоя при гиперполяризации за счёт проведения слабого тока калия внутрь клетки. Kir _ каналы обеспечивают движение ионов калия в клетку тогда, когда мембранный потенциал отрицателен по отношению к равновесному потенциалу калия, хотя они практически не поддерживают движения калия наружу клетки. Имеются, по крайней мере, пять подсемейств Kir - каналов Kjrl-КiГ5, обнаруженных в мозге, причем одно из них кодируется геном BirKl, продуцируя в качестве транскрипта белок Kcnj10 (Kir4.l). Показано, что данный белок Kir4.1 экспрессируется в астроцитах и олигодентроцитах сенсоматорной коры и гиппо- кампе, оказывая непосредственное влияние на функции глии, и опосредованно, на возбудимость нейронов, а также проводимость их аксонов.

Целью работы явилось сравнительное изучение особенностей экспрессии гена B ir k1 в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке в условиях контрольного принудительного плавания и при обучении пространственному навыку у взрослых крыс.

Эксперименты были выполнены на крысах -самцах Wistar (n=36, 3-х месячного возраста и массой 250,0±15,0 г.). Животные содержались в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде и 12-ти часовом световом режиме при соблюдении этических норм работы с экспериментальными животными, сформулированных Советом Европейского сообщества об использовании животных для экспериментальных исследований (Директива 86/609/EEC в пересмотре от 14.11.2005). Поведенческие эксперименты были проведены с использованием пространственного водного лабиринта Морриса (Columbus Instruments, USA) по протоколу, описанному ранее. Животные были разделены на 3 группы: 1 гр. - интактные крысы (n=12), 2 гр. - группа активного контроля (n=12), 3 гр. - обученные в водном лабиринте Морриса животные (n=12). Экспериментальный протокол составлен таким образом, что время плавания в группе активного контроля соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучавшемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна “контрольная” особь. Через 24 ч по окончании поведенческих экспериментов всех животных декапитировали и извлекали на холоду (+4ºС) структуры мозга: гиппокамп, префронтальную кору и мозжечок, которые использовали для изучения экспрессии гена Birkl методом ПЦР в режиме реального времени по описанному ранее протоколу, применяя в качестве референтного - ген в—акотпна для последующего расчёта относительно уровня экспрессии изучаемых генов по методу 2-AACt. Экспрессия гена Birkl в 2 и 3-й группах была оценена относительно интактных животных. Данные по экспрессии гена Birk1 у животных в группе «обучения» представлена в % по сравнению с группой «активный контроль». Статистическую обработку полученных результатов проводили по алгоритмам программы “Statistica 7,0”. При сравнении нескольких независимых выборок применяли однофакторный непараметрический дисперсионный анализ по методу Крускалла-Уолиса (Н-критерий) с последующим post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Данные представлены в виде M±m. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. В ходе проведенных поведенческих экспериментов в водном лабиринте Морриса по формированию долговременной пространственной памяти.

Показано, что среднее значение времени достижения платформы у крыс во втором и всех последующих сеансах было достоверно ниже, чем в первом (р<0,01–0,05), а к концу 4-го сеанса обучения значения времени достижения платформы были меньше 10 сек (р<0,01), что свидетельствует о формировании стабильной долговременной пространственной памяти

В результате проведенных исследований активности изучаемого гена Birk1 выявили специфические изменения в его экспрессии в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке животных в группах «активного контроля» и «обучения». Так, анализ межструктурной экспрессии гена Birk1 в мозгу у крыс, подвергнувшихся принудительному плаванию документировал, что активность гена Birk1 превышает в префронтальной коре более, чем в 100 раз (p≥0,01), таковую как в мозжечке, так и гиппокампе. Таким образом, физическая нагрузка в виде плавания в водном лабиринте в течение выполнения 5-ти дневного протокола индуцирует активацию транскрипции гена Birk1 в церебральных структурах, преимущественно в префронтальной коре половозрелых крыс.

Более выраженная экспрессия гена Birk1 в в префронтальной коре по сравнению с другими структурами мозга, вероятно, свидетельствует о необходимости поддержания определенного уровня функционирования калиевых каналов внутреннего выпрямления (K ir каналы) и поддержания калиевого тока в коре в условиях впервые ознакомления с водной средой и физической нагрузке.

Анализ транскрипционной активности гена Bitk1 при обучении пространственному навыку выявил значительное повышение экспрессии данного гена в гиппокампе (в 27 раз, p≥0,05) и мозжечке (более чем в 100 раз, p≥0,01) и незначительное повышение в префронтальной коре у обученных животных. Специфическая активация в ходе обучения в водном лабиринте Морриса экспрессии гена Bitk1 в мозжечке и гиппокампе у взрослых крыс является новым экспериментальным фактом участия белка Kcnj10 (Kir4.1) в механизмах формирования долговременной пространственной памяти и роли калиевых каналов K_ir типа в данных процессах. Корреляционный анализ выявил положительные взаимосвязи между экспрессией гена Bitk1 , регулирующего активность части калиевых каналов в гиппокампе и мозжечке и временем достижения платформы на 4 день обучения, что свидетельствует о том, что повышение экспрессии гена Bitk1 в этих церебральных структурах связано с фактом формирования долговременной памяти.

Полученные данные расширяют и углубляют современные представления о молекулярноклеточных механизмах когнитивных функций в норме и патологии. Эти данные позволят приблизиться к пониманию патогенеза заболеваний нерв- ной системы, обусловленных нарушениями генетической регуляции, в частности, активности калиевых каналов, а также могут быть использованы при разработке новых методов лечения, прогноза и диагностики заболеваний, сопровождающихся дефицитом памяти.