Генетические факторы риска развития острой ишемии мозга у пациентов молодого и среднего возраста

Введение. Высокая заболеваемость инсультом, составляющая в Российской Федерации 2,5–3,0 случая на 1000 населения в год, в современном обществе остается одной из наиболее значимых медицинских и социальных проблем. По данным НЦ неврологии РАМН, ежегодно инсульт поражает около 6 млн чел. в мире и более 400 тыс. – в России. Большую часть этих случаев как в нашей стране, так и в других развитых странах мира составляет ишемический инсульт (ИИ). Так, в структуре церебральных инсультов преобладают ишемические поражения головного мозга, доля которых составляет 80–85 %. Летальность в остром периоде инсульта в России достигает 35 %, увеличиваясь на 12–15 % к концу первого года после перенесенного инсульта [1]. Наряду с высокой смертностью нарушения мозгового кровообращения являются ведущей причиной инвалидизации у взрослых, обусловливая до 80 % частичной и до 10 % полной нетрудоспособности [7]. В последние годы отмечается рост распространенности заболеваний острыми нарушениями мозгового кровообращения, при этом увеличивается распространенность инсульта среди лиц трудоспособного возраста (до 65 лет) [3]. Таким образом, церебральный инсульт несет тяжелые моральные, социальные и экономические последствия.

Разработка и осуществление активных государственных стратегий в отношении охраны здоровья является перспективной задачей во многих странах мира, особенно в связи с прогнозируемым дальнейшим ростом заболеваемости инсультом [5]. Известно, что большинство ишемических инсультов относятся к мультифакторным заболеваниям, их развитие, клиническое течение и исход во многом обусловлены комплексным влиянием факторов внешней среды и наследственной предрасположенностью [4]. В связи с этим исследование случаев ишемического инсульта и факторов риска его развития представляет несомненный научный и практический интерес.

Одной из актуальных проблем современного здравоохранения является выяснение молекулярно-генетических основ развития сердечно-сосудистых заболеваний. В последние годы в связи с развитием методов молекулярной генетики интенсивно изучаются генетические факторы риска ишемического инсульта. При этом основным направлением генетических исследований является изучение ассоциаций генов-кандидатов с риском развития заболевания. В первую очередь это гены, продукты которых либо вовлечены в липидный гомеостаз, либо оперируют в системе свертывания крови, либо влияют на физиологию стенки сосудов. В основе развития ишемического инсульта лежат два основных процесса: атеросклероз и тромбоз церебральных артерий [6]. При этом атеросклеротические изменения сосудов более характерны для лиц пожилого возраста, у молодых пациентов больший вклад в формирование патологии вносят нарушения в системе коагуляции, приводящие к повышенному тромбообразо-ванию [2].

Исходя из вышеизложенного следует подчеркнуть, что полиморфизм генов системы гемостаза играет существенную роль в этиологии ишемического инсульта. Обнаружение биохимических или генетических маркеров тромбофилических состояний позволяет значительно повысить возможности проведения адекватного патогенетического лечения и профилактики острых нарушений мозгового кровообращения, и прежде всего у лиц молодого трудоспособного возраста, что имеет огромное медицинское и социальное значение.

Цель исследования. Анализ вклада генетических факторов риска острой ишемии мозга путем исследования мутаций в генах системы гемостаза у больных с ишемическим инсультом молодого и среднего возраста, изучение клинических особенностей течения острого периода ишемического инсульта в указанных группах больных.

Материалы и методы. Обследовано 108 больных в остром периоде ишемического инсульта в возрасте от 23 до 60 лет включительно, находившихся на лечении в неврологическом отделении для больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения ГУЗ «Центральная клиническая медико-санитарная часть» г. Ульяновска с 2012 по 2014 г. В числе обследованных было 42 женщины (38,9 %) и 66 мужчин (61,1 %). Средний возраст пациентов составил 55,70±7,43 года, средний возраст женщин – 56,10±6,02 года, мужчин – 55,30±8,32 года.

Всем больным проводилось тщательное клинико-инструментальное обследование, включающее исследование соматического и неврологического статусов, лабораторную, клинико-инструментальную диагностику, ДНК-диагностику. Оценка степени тяжести ишемического инсульта проводилась с использованием шкалы тяжести инсульта Национальных институтов здоровья США (The National Institutes of Health Stroke Scale – NIHSS) с интерпретацией результатов данной шкалы по критериям L.B. Goldstein et al. [8]. При суммарном результате менее 6 баллов определялся легкий инсульт, 7–12 баллов – инсульт средней степени тяжести, более 14 баллов – тяжелый инсульт. Оценка тяжести состояния и степени нарушения сознания проводилась с использованием шкалы Глазго (Glazgow). Диагноз ишемического инсульта у всех пациентов подтверждался методом нейровизуализации (всем пациентам проводилась КТ головного мозга в первые 24 ч от момента развития симптомов).

Распределение пациентов по группам в зависимости от размера очага ишемии проводилось в соответствии с классификацией Н.В. Верещагина и Л.К. Брагиной (1986) (большой инфаркт – весь бассейн средней мозговой артерии (СМА), средний инфаркт – бассейн корковых или глубоких ветвей СМА, малый – бассейн внутримозговых артерий, отходящих от передней, средней, задней мозговых, позвоночной и базилярной артерий, размер не превышает 1,0–1,5 см).

Группу контроля составили 60 практически здоровых людей славянской популяции, не имеющих цереброваскулярной патологии, сопоставимых по полу и возрасту с группой обследованных больных.

Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось в лаборатории НИИ Ульяновского государственного университета. Экстракция геномной ДНК проводилась из лейкоцитов замороженной венозной крови с использованием набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ». Генетические полиморфизмы изучались с использованием комплекта реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития тромбофилии, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени «КардиоГенетикка Тромбофилия» («ДНК-Технология», Россия). ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе в реальном времени CFX96.

Проводился анализ полиморфизмов генов, кодирующих белки системы свертывания крови и гемостаза. Для исследования были выбраны описанные в литературе мутации генов-кандидатов ишемического поражения головного мозга: мутация 20210G>A гена FII, мутация 1691G>A гена FV, мутация 10976G>A гена FVII, мутация -455G>A гена FGB, мутация -675 5G>4G гена PAI-1, мутация 807C>T гена ITGA2, мутация 1565Т>С гена ITGB3.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета программ «Статистика 8.0». При описании результатов исследования количественные данные представлены в виде M±σ, где М – среднее арифметическое, σ – стандартное отклонение; качественные данные представлены в виде абсолютных значений и процентов. Группы сравнивались по качественным данным с помощью критерия χ2, точного критерия Фишера. Достоверность различий в выборках по количественным признакам оценивалась по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при уровне вероятности более 95 % (p<0,05).

Результаты и обсуждение. Клиническая характеристика больных с ИИ в исследуемой группе. Распределение больных по возрастным группам показало преобладание больных с ИИ в возрасте 50–59 лет – 52,8 % (57 чел.) и в возрасте 60 лет – 30,5 % (33 чел.). В возрасте 20–29 лет было выявлено 1,9 % больных (2 чел.), 30–39 лет – 3,7 % (4 чел.), 40–49 лет – 11,1 % (12 чел.).

Ишемический очаг наиболее часто локализовался в области полушарий – 80,6 % (n=87), при этом в бассейне левой средней мозговой артерии – в 44,5 % случаев (n=48), в бассейне правой средней мозговой артерии – в 22,2 % (n=24), в бассейне левой задней мозговой артерии – в 5,6 % (n=9). Локализация ишемического инсульта в вертебральнобазилярном бассейне выявлена у 19,4 % (n=21) обследованных пациентов, из них у 71,4 % (n=15) очаг ишемии выявлен в стволе головного мозга, у 28,6 % (n=6) – в мозжечке. В 8,3 % случаев (n=9) наблюдались два «свежих» ишемических очага: в мозжечке и в таламической области.

По результатам КТ головного мозга в группе обследованных пациентов отмечалось преобладание средних инфарктов – 58,3 % (n=63), малые (лакунарные) инфаркты наблюдались в 22,3 % случаев (n=24), большие – в 19,4 % (n=21).

При оценке неврологического статуса пациентов в остром периоде ИИ было выявлено, что в 41,7 % случаев (n=45) ведущим неврологическим синдромом являлись нарушения двигательной сферы, при этом плегия наблюдалась в 31,1 % (n=14) случаев, глубокие парезы (до 2 баллов) – в 22,2 % (n=10), умеренные парезы (3 балла) – в 33,3 % случаев (n=15), легкие парезы (4 балла) – в 13,3 % (n=6). Нарушения в сфере чувствительности отмечались у 2,8 % обследованных пациентов (n=3). Вестибуло-мозжечковый синдром являлся ведущим синдромом у 8,3 % пациентов (n=9). Изолированная афазия диагностирована также у 9 пациентов (8,3 %), у 4 (44,4 %) из которых выявлена тотальная афазия, у 2 (22,3 %) – моторная, у 3 (33,3 %) – cенсо-моторная афазия. Бульбарный синдром являлся ведущим у 5,6 % пациентов (n=6), глазодвигательные нарушения диагностированы в 2,8 % случаев (n=3). У 33 пациентов (30,5 %) наблюдалось сочетание неврологических синдромов, равноценных по степени выраженности. Так, сочетание тотальной афазии и гемиплегии отмечено у 54,5 % больных (n=18), бульбарного синдрома и нарушений двигательной сферы – у 36,4 %

(n=12), нарушений в координаторной сфере и гемипареза – у 9,1 % (n=3).

При оценке степени тяжести ИИ по шкале NIHSS было выявлено преобладание инсульта средней тяжести – у 51 пациента (47,2 %), 27 пациентов (25 %) имели тяжелый инсульт, 30 больных (27,8 %) – легкий. Средняя оценка по шкале NIHSS в группе обследованных пациентов составила 10,38± ±6,34 балла, в группе мужчин – 12,54± ±6,70 балла, в группе женщин – 7,0±3,7 балла. Тяжелый инсульт чаще наблюдался в группе мужчин по сравнению с группой обследованных женщин (24 и 3 больных соответственно), но данные различия не достигали уровня статистической значимости (p>0,05).

Нарушение сознания различной глубины в остром периоде ИИ зарегистрировано у 21 пациента (19,4 %). Из них в оглушении (13–14 баллов по шкале Глазго) находились 15 больных (13,9 %), в сопоре (9–12 баллов по шкале Глазго) – 6 больных (5,6 %). Глубокого нарушения сознания (менее 8 баллов по шкале Глазго) зафиксировано не было. Летальный исход в остром периоде инсульта зафиксирован у 7 пациентов (6,5 %). У всех отмечалась большая зона инфаркта по данным КТ головного мозга (в пределах всего бассейна СМА), тяжёлая степень инсульта по шкале NIHSS согласно критериям L.B. Goldstein et al.

Анализ мутаций в генах системы гемостаза. При анализе распределения полиморфных вариантов исследуемых генов системы гемостаза было выявлено преобладание в группе больных с ИИ полиморфных генотипов, ассоциированных с повышенным риском тромбофилии, – мутации гена FGB, гена PAI-1, гена FV (Лейденская мутация) и гена ITGB3.

Мутация 20210G>A в гене протромбина (FII). Протромбин, или коагуляционный фактор II, является одним из главных компонентов свертывающей системы крови. Мутация гена FII проявляется в замене гуанина (G) на аденин (А) в позиции 20210 и обозначается как генетический маркер 20210G>А. Изменение происходит в регуляторном участке гена, поэтому нарушения структуры белка не происходит, но это влияет на регуляцию синтеза белка. У носителей аллеля А обнаруживается повышенный уровень протромбина в крови. Следовательно, риск образования тромбов возрастает. Мутация в гене FII наследуется по аутосомно-доминантному типу, поэтому патологический эффект реализуется даже при наличии одной копии поврежденного гена (генотип G/A).

При сравнении наблюдаемых частот отдельных генотипов в гене FII выявлено достоверное преобладание гетерозиготного генотипа G/A в группе больных с ИИ (14,8 %) по сравнению с группой контроля (1,7 %) (p=0,002). Гомозиготный генотип А/А, ассоциированный с наибольшим риском тромбо-филических состояний, среди обследованных лиц выявлен не был.

Мутация 1691G>A (Лейденская) в гене фактора свертывания крови V. Полиморфизм (1691G>A) гена FV обусловлен заменой нуклеотидного основания гуанина (G) на аденин (A) в положении 1691, что приводит к аминокислотной замене аргинина на глутамин в позиции 506. Замена аминокислоты придает устойчивость активной форме фактора Лейдена к расщепляющему действию регулирующего фермента, что приводит к гиперкоагуляции крови. Носители варианта А обладают повышенной склонностью к развитию сосудистых тромбозов, являющихся фактором риска венозных и артериальных тромбоэмболий, инфаркта миокарда и инсульта. Гетерозиготными носителями Лейденской мутации являются 4–6 % европейского населения, причем риск тромбообразо-вания увеличивается в 3–7 раз при гетерозиготном и в 80 раз при гомозиготном носительстве.

При анализе Лейденской мутации (1691G>A) были выявлены статистически значимые различия в общем распределении наблюдаемых генотипов между группой больных с ИИ и контрольной группой. При сопоставлении частот отдельных генотипов было установлено, что гетерозиготное носительство Лейденской мутации (генотип G/A) достоверно чаще встречается в группе больных с ИИ (24,1 %) по сравнению с контрольной группой (5 %, p=0,01). Нейтральный генотип G/G выявлен у 91,7 % лиц из группы контроля и у 75,9 % больных с ИИ. Данные различия являются статистически значимыми (p=0,02).

Мутация 10976G>A в гене фактора свертывания крови VII. Изменения в гене FVII в большинстве случаев имеют протек-тивный эффект относительно риска развития тромбоэмболии. Замена гуанина (G) на аденин (А) в позиции 10976 (генетический маркер 10976G>A) приводит к изменению биохимических свойств фактора VII, в котором происходит замена аминокислоты аргинина на глутамин. Снижение активности FVII в результате замены способствует уменьшению тромбообразования. Генотип А/А является причиной снижения активности фермента FVII на 72 % по сравнению с диким типом (генотип G/G).

Анализ наблюдаемых частот генотипов гена протромбина (FVII) в группе больных и группе контроля показал статистически значимые различия в общем распределении генотипов. При сопоставлении частот отдельных генотипов выявлено статистически значимое преобладание генотипа G/G в группе контроля (100 %) по сравнению с группой больных ИИ (58,3 %, p=0,01). В то же время определены статистически значимые различия по частоте встречаемости гетерозиготного носительства 10976G>A в гене протромбина (мутантный генотип G/A). В группе больных с ИИ данный генотип был выявлен у 33,3 % больных, тогда как в контрольной группе ни у кого из обследованных данная мутация не выявлена (p=0,00001). Гомозиготный мутантный генотип А/А, ассоциированный со снижением риска тромбообразо-вания, встречался у 8,3 % больных с ИИ, тогда как в контрольной группе ни у кого из обследованных данный генотип не выявлен.

Мутация -455G>A в гене фибриногена. Замена гуанина (G) на аденин (А) в позиции -455 приводит к увеличению содержания фибриногена в крови и повышению вероятности образования тромбов, что способствует увеличению риска тромбоза мозговых сосудов.

При анализе мутации 455G>A гена фибриногена нами были выявлены статистически значимые различия в общем распределении наблюдаемых генотипов между группой больных с ИИ и группой контроля. Установ- лено, что в группе больных с ИИ достоверно чаще встречается гетерозиготное носительство (мутантный генотип G/A) (38,8 %), чем в группе контроля (13,3 %, p=0,0004). Гомозиготный мутантный аллель А/А был выявлен только в группе больных с ИИ и встречался у 3,7 % обследованных больных, различия между группами больных и контроля в распределении мутантного генотипа A/A статистически незначимы (p=0,29).

Мутация -675 5G>4G в гене SERPINE1 (PAI-1). Ген SERPINE1 кодирует белок – эндотелиальный ингибитор активатора плазминогена-1 (ИАП-1), принадлежащий семейству серпинов. Белок ИАП-1 ингибирует, т.е. замедляет работу, тканевого активатора плазминогена и урокиназы, которые в свою очередь активируют переход плазминогена в плазмин, расщепляющий фибрин тромбов. Таким образом, SERPINE1 негативно воздействует на фибринолиз и препятствует растворению тромбов, что повышает риск сосудистых осложнений, различных тромбоэмболий. Полиморфизм -675 5G>4G проявляется в изменении количества повторов гуанина (G) в промоторной (регуляторной) области гена. Существует два варианта гена с разным количеством повторов гуанина в позиции -675: 5G обозначает наличие последовательности из пяти оснований гуанина, 4G – наличие последовательности из четырех оснований гуанина – это неблагоприятный вариант, приводящий к ослаблению фибринолитической активности крови. Гомозиготная мутация 4G/4G полиморфизма -675 5G/4G является фактором риска развития тромбозов, инфаркта миокарда, ишемического инсульта. Распространенность гомозиготной формы 4G/4G в европейских популяциях составляет 5–8 %.

При анализе мутации -675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена установлено, что гетерозиготное носительство -675 5G>4G достоверно чаще встречалось в группе больных с ИИ (63,9 %) по сравнению с группой контроля (33,3 %, p=0,002). Гомозиготный мутантный генотип 4G/4G, ассоциированный с наибольшим риском тромбо-образования, наблюдался у 2,8 % больных с ИИ, тогда как в группе контроля ни у кого из обследованных данный генотип не выявлен

(p>0,05). Также было установлено, что носители «нейтрального» генотипа 5G/5G достоверно чаще встречаются в группе контроля (66,7 %) по сравнению с группой больных ИИ (33,3 %, p=0,00004).

Мутация 807С>Т в гене ITGA2. Ген ITGA2 кодирует белок альфа-2-мембранный гликопротеин, известный как GPIa, экспрессирующийся на мембранах различных клеток. На мембране тромбоцитов GPIa образует комплекс с GPIIa, представляющий собой один из рецепторов коллагена. Полиморфизм 807С>Т представляет собой нуклеотидную замену цитозина (С) на тимин (Т) в позиции 807. Наличие Т-аллеля ассоциируется с увеличением скорости адгезии тромбоцитов, что может являться фактором риска тромбофилии. В работах различных исследователей показана ассоциация наличия аллеля Т и риска развития ишемического инсульта, особенно в молодом возрасте.

При анализе полиморфизма 807С>Т гена ITGA2 также выявлены статистически значимые различия в общем распределении наблюдаемых частот генотипов между группой больных с ИИ и группой контроля. Гомозиготный «мутантный» генотип Т/Т достоверно чаще встречался у лиц, перенесших ИИ (14,8 %); в контрольной группе данного генотипа выявлено не было. «Нейтральный» генотип С/С встречался статистически значимо чаще в группе лиц, не страдающих цереброваскулярной патологией (88,9 %), чем среди больных с ИИ (63,9 %, p=0,0005).

Мутация 1565Т>С в гене ITGВ3. Ген ITGB3 кодирует белок интегрин бета-3 (ITGB3) – мембранный гликопротеин, известный как тромбоцитарный гликопротеин IIIа (platelet glycoprotein GPIIIa). На мембране тромбоцитов GPIIIa образует комплекс с GPIIb, представляющий собой тромбоцитарный рецептор фибриногена. Полиморфизм 1565Т>С обусловлен заменой тимина (Т) на цитозин (С) в позиции 1565. В результате такой замены меняются биохимические свойства белка GPIIIa, в котором аминокислота лейцин замещается на пролин в позиции 59 (Leu59Pro). Тромбоциты носителей С-аллеля имеют повышенную склонность к агрегации, что может являться увеличением риска тром- бообразования, приводящего к сердечнососудистой патологии.

При анализе полиморфизма 1565Т>С в гене ITGВ3 статистически значимых различий в общем распределении наблюдаемых частот генотипов между группой больных с ИИ и группой контроля выявлено не было.

Выводы:

A.N. Ovsyannikova, V.V. Mashin, L.A. Belova, Y.V. Saenko

Ulyanovsk State University