Генетические маркеры прогноза рецидива и лимфогенного метастазирования рака мочевого пузыря

В последние десятилетия отмечается рост числа всех онкологических заболеваний, в том числе РМП. На момент постановки диагноза у 70–85% больных выявляется поверхностный РМП (ПРМП) [1]. После лечения до 85% ПРМП рецидивирует, причем 10–30% прогрессируют в инвазивные и диссеминированные формы [4]. По данным литературы, при первичном инвазивном раке 3-летняя выживаемость не превышает 67%, а при прогрессирующем из поверхностного – вполовину меньше (37%) [17].

Радикальная цистэктомия с тазовой лимфаденэктомией является “золотым стандартом” лечения мышечно-инвазивного РМП. Выживаемость после радикальной цистэктомии предопределяется стадией (Т), состоянием хирургического края и наличием поражения лимфатических узлов. Общепризнано, что наличие лимфогенного метастазирования значительно ухудшает прогноз заболевания, а существующие методы оценки риска лимфогенного метастазирования не имеют достаточной достоверности [9, 10, 12–14, 18]. Не прекращаются дискуссии об объеме проведения лимфаденэктомии [9, 18]. Исследователи всего мира ведут поиск дополнительных маркеров прогноза риска лимфогенного метастазирования при

РМП. Таким образом, одной из ключевых проблем, с которой сталкивается врач при лечении таких больных, является оценка риска развития рецидива заболевания РМП [5].

Наиболее перспективным направлением в этой области является, с нашей точки зрения, определение молекулярно-генетических изменений в наследственном аппарате клетки, возникающих в условиях болезни, и использование их в качестве клинических маркеров, определяющих характер и прогноз заболевания [2, 11]. В клетке имеется двойной контроль, предотвращающий развитие мутационного процесса. Это системы, обеспечивающие репарацию ДНК, либо системы, индуцирующие гибель измененной клетки в случае многочисленных повреждений ДНК (апоптоз, некроз). Нарушения в репарационных процессах приводят к накоплению повреждений в ДНК. В случае сбоев в системе, контролирующей и запускающей апоптоз, может происходить формирование жизнеспособного мутагенного генотипа. Ген XRCC1 расположен на 19-й хромосоме в локусе 19q13.2. Продукт гена XRCC1 является важным компонентом эксцизионной репарации оснований. Он исправляет поврежденные основания и одноцепочечные разрывы, вызванные ионизирующей радиацией и алкилирующими агентами [6, 15,

16, 19, 20].

Генетический полиморфизм в генах системы биотрансформации ксенобиотиков, ассоциированный с изменением соответствующих ферментов, может влиять на характер роста опухоли, частоту рецидива ПРМП, частоту лимфогенного метастазирования. Особого внимания заслуживают гены семейства цитохрома Р450 [3, 7, 8]. Цитохромы Р450 1А1 осуществляют биологическую активацию проканцерогенов, в частности бензапирена, и некоторых других полиароматических углеводородов. По литературным данным, полиморфизм А2455G гена CYP1A1 ассоциирован с повышенным риском развития РМП [8]. Наиболее функционально значимыми полиморфизмами гена CYP1А2 являются CYP1A2*1D (T-2467delT) и CYP1A2*1F (С-163А) [8, 9]. Установлено, что полиморфизм 1 интрона гена CYP1A2*1F приводит к изменению каталитической активности фермента и увеличению его индуцибельности.

Необходимость определения прогностического значения молекулярно-генетических маркеров РМП послужила основанием для проведения данной работы и стала ее целью.

Материал и методы

Мы проанализировали результаты лечения 104 пациентов (n=104) с диагнозом ПРМП и 104 пациентов с инвазивным РМП (ИРМП) – всего 208 человек, находившихся на стационарном лечении в клинике БГМУ, РКОД и РКБ Уфы (РБ) в период с 2005 по 2009 гг. Средний возраст больных составил 59,71±6,21 лет. Все обследованные принадлежали к русской этнической группе.

Срок наблюдения за пациентами с ПРМП составил от 1 до 4 лет после радикальной трансуретральной резекции (ТУР) первичной опухоли мочевого пузыря. В течение первого года наблюдения рецидивные опухоли возникли у 57 (54,81%) больных и они вошли в основную группу ПРМП (n=57). Пациенты без рецидива составили контрольную группу (n=47). Всем больным ИРМП была выполнена радикальная цистэктомия с одномоментной реконструктивной операцией. Разделение больных на группы производилось в зависимости от результатов гистологического исследования лимфатических узлов. Контрольную группу ИРМП составили больные, не имевшие лимфогенной инвазии (44 пациента), основную группу ИРМП – пациенты с гистологически подтвержденным поражением лимфоузлов (60 чел.).

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови. Для выделения ДНК использовался стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции с небольшими модификациями (микрометод). Анализ полиморфных локусов генов цитохромов P450: CYP1А1 (A2455G), СYP1A2 (T-2464delT), (номенклатура аллелей приведена согласно данным, приведенным на сайте Cytochrome P-450 (CYP) genes: a web page for the nomenclature of alleles, созданным 9-Sep-2008); глутатион S-трансферазы GSTM1 (del) и GSTP1 (A313G); репарации ДНК: XRCC1 (G28152A) проводили методом полиме- разной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локус-специфических олигонуклеотидных праймеров. Ампли-фицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоре-тически в полиакриламидном неденатурированном геле (ПААГ).

Статистическая обработка цифровых данных проводилась при помощи программы STATISTICA 6.0. Разницу в распределении частот генотипов между группами рассчитывали с использованием непараметрического критерия χ ² с поправкой Иэйтса. Определяли показатели отношения рисков, соответствующих 95% доверительным интервалам (95% CI). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Проведен анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP1A2, GSTM1, GSTP1, XRCC1 у больных с ПРМП (табл. 1).

Сравнение основной и контрольной групп больных по распределению частот генотипов и аллелей ( χ ²=5,54; р=0,02) полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1 показало статистически значимые различия между группами ( χ ²=7,44; р=0,02). Так, у больных ПРМП основной группы по сравнению с больными контрольной выявлено статистически значимое повышение частоты гетерозигот *1A*2С (42,11 и 19,15% соответственно; р=0,02). Частота аллеля *2C полиморфного локуса A2455G гена CYP1А1 у больных ПРМП основной группы оказалась повышенной до 22,81 против 9,57% в контрольной группе (р=0,02). В обеих подгруппах преобладал генотип *1A*1A и аллель *1A. Частота генотипа *1A*1A составила в группе контроля 80,85%, тогда как в основной группе – 56,14% (р=0,01).

Нами был проанализирован полиморфный локус Т-2467delT гена CYP1A2 с учетом рецидива ПРМП в течение года после операции (табл. 1). Анализ распределения частот генотипов ( χ ²=6,54; р=0,04) и аллелей ( χ ²=12,76; р=0,01) данного полиморфного локуса выявил статистически достоверные различия между группами. Частота генотипа *1А*1D у больных основной группы увеличена до 54,38%, в то время как в контрольной группе она составила 23,40% (p=0,01). Частота аллеля *1D у больных ПРМП основной группы увеличивалась почти в 2 раза (39,47%) по сравнению с контрольной группой (15,96%; p=0,01). C другой стороны, частота генотипа *1A*1A оказалась выше у больных контрольной группы (72,34 против 33,33% в группе контроля; p=0,01). Сравнение распределения частот генотипов гена GSTM1 у больных ПРМП с учетом рецидива заболевания не выявило статистически достоверных различий между группами ( χ ²=1,09; р=0,30).

В группе ПРМП анализировалась частота встречаемости полиморфного локуса A313G гена GSTP1 с учетом рецидива заболевания (табл. 1). Выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов ( χ ²=6,45; р=0,04) и аллелей ( χ ²=5,98; р=0,02) между группами. Аллель G маркера A313G гена GSTP1 у больных основной подгруппы встречался достоверно чаще (28,07%), тогда как в контрольной подгруппе частота его

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP1A2, GSTM1, GSTP1, XRCC1 у больных с поверхностным РМП

Генотипы Основная группа Контрольная группа χ2 p OR (95% CI) Абс. Частота (%) Абс. Частота (%) Полиморфный локус A2455G гена CYP1A1 *1A*1A 32 56,14 38 80,85 6,06 0,01 0,30 (0,11–0,80) *1A*2C 24 42,11 9 19,15 5,25 0,02 3,07 (1,15–8,33) *2C*2C 1 1,75 0 0 0,01 1,00 - *1A 88 77,19 85 90,43 5,54 0,02 0,36 (0,15–0,86) *2C 26 22,81 9 9,57 2,79 (1,16–6,85) Полиморфный локус Т-2467delT гена CYP1A2 *1A*1A 19 33,33 34 72,34 14,16 0,01 0,19 (0,08–0,48) *1A*1D 31 54,38 11 23,40 9,02 0,01 3,90 (1,54–10,06) *1D*1D 7 12,28 2 4,26 1,21 0,27 - *1A 69 60,53 79 84,04 12,76 0,01 0,29 (0,14–0,59) *1D 45 39,47 15 15,96 3,44 (1,68–7,09) Делеционный полиморфизм гена GSTM1 +/+ 32 56,14 32 68,08 1,09 0,30 – del 25 43,86 15 31,92 Полиморфный локус A313G гена GSTP1 AA 30 52,63 35 76,09 5,05 0,03 0,35 (0,14–0,89) AG 22 38,60 10 21,74 2,63 0,10 - GG 5 8,77 1 2,17 0,99 0,32 - A 82 71,93 80 86,96 5,98 0,02 0,38 (0,17–0,84) G 32 28,07 12 13,04 2.60 (1,18–5,78) Полиморфный локус G28152A гена XRCC1 GG 16 28,07 20 42,55 1,79 0,18 - GA 30 52,63 21 44,68 0,37 0,54 - AA 11 19,30 6 12,77 0,39 0,53 - G 62 54,39 61 64,89 1,94 0,16 - A 52 45,61 33 35,11 - составила 13,04% (р=0,02). В то же время частота гомозиготного генотипа АА оказалась выше в контрольной группе 76,09% по сравнению с таковой в основной группе – 52,63% (р=0,03). Сравнение распределения частот генотипов и аллелей полиморфного варианта G28152A гена XRCC1 у больных ПРМП с учетом рецидива заболевания не выявило статистически достоверных различий между группами (χ2=2,57; р=0,28).

Аналогичный анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP1A2, GSTM1, GSTP1, XRCC1 выполнялся у больных ИРМП (табл. 2).

Сравнительный анализ в группах больных ИРМП с наличием лимфогенных метастазов и без них выявил статистически значимые различия в распределении частот генотипов(χ2=9,36; р=0,01) и аллелей (χ2=8,26; p=0,01) маркера A2454G гена CYP1A1 между этими группами больных (табл. 2). Частота аллеля *2С у больных с лимфогенным метастазированием РМП увеличивалась (33,3%) по сравнению с выборкой больных без лимфогенного метастазирования РМП (14,8%), а аллель *1A чаще выявлялась у больных без лимфогенного метастазирования (85,2 против 66,7% у больных с лимфогенным метастазированием РМП). Нами отмечена тенденция к увеличению частоты генотипа *1A*2С у больных с лимфогенным метастазированием РМП (46,7%) по сравнению с больными без такового – 25,0% (χ2=4,20; р=0,04). У больных без лимфогенного метастазирования чаще выявлялся генотип *1A*1A (72,7%), чем у больных с лимфогенным метастазированием – 43,3% (χ2=7,74; р=0,01).

Сравнительный анализ полиморфного локуса T-2467delT гена CYP1A2 установил статистически достоверные различия между группами больных ИРМП по распределению частот генотипов ( χ ²=10,31, р=0,01) и аллелей ( χ ²=11,89; р=0,01), таблица 2. Частота генотипа *1D*1D у больных с лимфогенным метастазированием (33,3%) оказалась выше по сравнению с больными без лимфогенного метастазирования – 13,6% ( χ ²=4,26; р=0,04). В свою очередь частота генотипа *1A*1A (56,8%) была больше у больных без лимфогенного метастазирования по сравнению с больными с лимфогенным метастазированием ИРМП – 26,7% ( χ ²=8,44; р=0,01). Оказалось, что аллель *1D повышает риск развития лимфогенного метастазирования у больных ИРМП (OR=2,88; 95% CI 1,54– 5,41).

Сравнительный анализ не выявил статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей делеционного полиморфизма гена GSTM1 между подгруппами больных с ИРМП ( χ ²=1,34; p=0,25). В то же время между подгруппами больных ИРМП установлены статистически значимые различия по распределению частот генотипов ( χ ²=8,08, р=0,02) и аллелей ( χ ²=5,54; р=0,02) полиморфного локуса A313G гена GSTP1 (табл. 2). Частота аллеля G у больных с лимфогенным метастазированием оказалась выше (46,7%) по сравнению с больными без такового (29,6%). В свою очередь частота аллеля A (70,5%) увеличивалась у больных без лимфогенного метастазирования по сравнению с пациентами с лимфо-

Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP1A2, GSTM1, GSTP1, XRCC1 у больных инвазивным РМП

Генотипы и аллели Основная группа Контрольная группа χ2 р OR (95% CI) Абс. Частота (%) Абс. Частота (%) Полиморфный локус A2455G гена CYP1A1 *1A*1A 26 43,3 32 72,7 7,74 0,01 0,29 (0,11–0,72) *1A*2C 28 46,7 11 25,0 4,20 0,04 2,63 (1,04–6,73) *2C*2C 6 10,0 1 2,3 1,34 0,25 - *1A 80 66,7 75 85,2 8,26 0,01 0,35 (0,16–0,73) *2C 40 33,3 13 14,8 2,89 (1,36–6,19) Полиморфный локус Т-2467delT гена CYP1A2 *1A*1A 16 26,7 25 56,8 8,44 0,01 0,28 (0,11–0,68) *1A*1D 24 40,0 13 29,5 0,80 0,37 - *1D*1D 20 33,3 6 13,6 4,26 0,04 3,17 (1,05–9,95) *1A 56 46,7 63 71,6 11,89 0,01 0,35 (0,19–0,65) *1D 64 53,3 25 28,4 2,88 (1,54–5,41) Делеционный полиморфизм гена GSTM1 +/+ 33 55,0 30 68,2 1,34 0,25 – del 27 45,0 14 31,8 – Полиморфный локус A313G гена GSTP1 AA 17 28,33 19 43,2 6,84 0,01 0,30 (0,12–0,76) AG 33 55,0 21 47,7 2,98 0,08 - GG 10 16,7 4 9,1 0,69 0,41 - A 64 53,3 62 70,5 5,54 0,02 0,48 (0,26–0,89) G 56 46,7 26 29,6 2,09 (1,12–3,90) Полиморфный локус G28152A гена XRCC1 GG 8 13,3 17 38,6 7,57 0,01 0,24 (0,08–0,70) GA 33 55,0 15 34,1 3,66 0,06 - AA 19 31,7 12 27,3 0,07 0,79 - G 49 40,8 49 55,7 3,92 0,047 0,55 (0,30–0,99) A 71 59,2 39 44,3 1,82 (1,01–3,30) генным метастазированием ИРМП (53,3%). Частота генотипа АА была выше у больных без лимфогенного метастазирования ИРМП по сравнению с больными с таковым (43,2 и 28,3% соответственно; χ2=6,84; р=0,01).

В группе больных ИРМП проведен также анализ полиморфного локуса G28152A гена XRCC1 с учетом лимфогенного метастазирования (табл. 2). Установлены статистически значимые различия между группами в распределении частот генотипов ( χ ²=9,33; р=0,01) и аллелей ( χ ²=3,92; р=0,047). Аллель А маркера G28152A данного гена в группе больных ИРМП с лимфогенным метастазированием встречался достоверно чаще (59,2%), тогда как у больных без такового его частота составила 44,3% (р=0,047). В то же время встречаемость гомозиготного генотипа АА оказалась выше у больных без лимфогенного метастазирования (38,6%) по сравнению с таковой в подгруппе с лимфогенным метастазированием – 13,3% (р=0,01).

В доступной литературе мы не встретили работ, посвященных изучению ассоциации данных генотипов с рецидивом ПРМП. В результате проведенного нами исследования установлено, что маркерами предрасположенности к развитию рецидивов в группе первичного ПРМП является целый ряд генетических маркеров, отражающих высокий риск такового: генотип *1A*2C (OR=3,07; 95% CI 1,15–8,33) и аллель *2C (OR=2,79; 95% CI 1,16–6,85) полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1; генотип *1A*1D (OR=3,90, 95% CI 1,54–10,06) и аллель *1D (OR=3,44; 95% CI 1,68–7,09) полиморфного локуса Т-2467delT гена

CYP1A2; аллель G (OR=2,60; 95% CI 1,18–5,78) полиморфного локуса A313G гена GSTP1. Пациентам, имеющим данные предрасполагающие факторы, мы назначали интраоперационную химиопрофилактику, а в послеоперационном периоде обязательное проведение химио- или иммунопрофилактики. Контроль состояния оперированных больных выполнялся ежемесячным ультразвуковым сканированием мочевого пузыря и цистоскопией не менее 1 раза в 3 мес. До получения представленных результатов генетического исследования удаленной опухоли мы не были уверены, насколько агрессивен ее рост, нужно ли проводить интраоперационную химиопрофилактику, какова вероятность рецидива заболевания и по какой схеме наблюдать пациента (т.е. с какой частотой проводить ультразвуковые исследования мочевого пузыря, цистоскопии и т.д.).

Как известно, золотым стандартом лечения ИРМП считается радикальная цистэктомия. При ее выполнении хирург стоит перед дилеммой, какой объем лимфодисек-ции произвести: стандартный или расширенный. С одной стороны, расширенная лимфодисекция позволяет удалить пораженные раком лимфоузлы, с другой, – значительно увеличивает время операции и тяжесть самого вмешательства. При этом существующие методы доопе-рационного обследования (компьютерная и магнитнорезонансная томография) не всегда дают ответ на вопрос о наличии или отсутствии лимфогенной инвазии. В современной доступной нам литературе работ, посвященных изучению ассоциации генетических маркеров с лим- фогенной инвазией ИРМП, мы также не встретили. В то же время выполненные нами исследования показали, что именно такие маркеры, как аллель *2С (OR=2,89; 95% CI 1,36–6,19) и генотип *1А*2С (OR=2,63; 95% CI 1,04–6,73) полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1; аллель *1D (OR=2,88; 95% CI 1,54–5,41) и генотип *1D*1D (OR=3,17; 95% CI 1,05–9,95) полиморфного локуса T-2467delT гена CYP1A2; аллель G (OR=2,09; 95% CI 1,12–3,90) полиморфного локуса A313G гена GSTP1; аллель A (OR=1,82; 95% CI 1,01–3,30) полиморфного локуса G28152A гена XRCC, предрасполагают к развитию лимфогенного метастазирования у больных ИРМП.

Заключение

Таким образом, ценность полученной информации, как нам представляется, состоит в том, что диагностика данных генетических маркеров у пациентов с РМП позволяет строить индивидуальный план хирургического и терапевтического вмешательств: планировать объем лимфодисекции при радикальной цистэктомии, решать, проводить или нет интраоперационную химиопрофилактику, а в послеоперационном периоде – обязательную химио- или иммунопрофилактику, определять, по какой схеме наблюдать пациента в дальнейшем.