Генетические особенности абдоминального ожирения у подростков г.о. Самара

Введение. Ожирение становится все более и более важной проблемой клинического здравоохранения во всем мире. Данная проблема является результатом сложных взаимодействий между наследственными факторами и факторами окружающей среды. Несколько генов, как известно, способствуют ожирению. Рецептор гена лептина (LEPR) широко изучен среди этих генов [1–4]. Лептин – производное адипоцитов, и его эффект направлен на регулирование получаемой из пищи энергии и ее расходами, путем связывания с определенными рецепторами в гипоталамусе [4, 5].

Рецепторы лептина наиболее представлены в мозге и гипоталамусе, но они также широко распределены в периферийных тканях, включая жирную ткань, печень, почки, поджелудочную железу и гонады. LEPR расположен в хромосоме 1p31 и относится к семейству цитокиновых рецепторов [5]. Гомозиготная мутация LEPR является очень редкой и выявляется у редких тучных индивидуумов [6]. Однако проведено много исследований, которые указали на ассоциацию между некоторыми полиморфизмами LEPR и ожирения и связанными с ожирением нарушениями [1, 2, 5, 9]. Полиморфизм Gln223Arg, в частности один из наиболее изученных полиморфизмов LEPR у тучных людей. Было проведено несколько исследований о его отношении к ожирению, в том числе в детском возрасте [1, 2, 5]. В Самарской области не проводилось исследований, изучающих отношения между полиморфизмом LEPR и ожирением у детях.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить отношения между полиморфизмом LEPR Gln223Arg и ожирением у детях г.о. Самара.

Материалы и методы. Для достижения поставленной цели были проведены исследования. Обследованы 100 пациентов с избыточной массой тела, обратившихся за медицинской помощью в отделение эндокринологии ММУ Детской городской клинической больницы № 1

имени Н.Н. Ивановой. У 50 из этих пациентов была взята кровь для исследования на наличие мутации генов рецептора лептина. У 25 детей без ожирения (индекс массы тела менее 85 перцентиля) и избыточной массы тела также была взята кровь для исследования мутаций гена рецептора лептина.

Дети с ожирением на фоне генетического синдрома, с гипоталамическим ожирением или дети с ожирением центрального генеза были исключены из исследования. Критерии метаболического синдрома у детей с ожирением определялись согласно международным критериям федерации диабета (IDF) 2007 года. Было оформлено письменное информированное согласие со всеми родителями детей.

Проведены антропометрические исследования, которые проводились в первую половину дня, а также комплексное клинико-инструментальное обследование. Рост измеряли с помощью стандартного вертикального ростомера с откидным табуретом с точностью до 0,5 см. Массу тела измеряли в нижнем белье с точностью до 0,1 кг с помощью напольных биоимпе-дансных весов Omron BF 508.

Артериальное давление (АД) измеряли у детей на обеих руках, сидя, спустя 5 минут отдыха; определяли среднее систолическое (САД) и среднее диастодическое АД (ДАД). Забор крови проводили натощак после ночного голодания. Биохимический анализ сыворотки проводился стандартизованным ферментативным методом с помощью многоканального автоматического биохимического анализатора Hitachi 902 «Roshe Diagnostics» (Германия) и включал определение уровней общего холестерина (ОХС), холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП, триглицеридов (TГ), глюкозы. Инсулин определяли иммунорадиометрическим методом.

Индекс массы тела (ИМТ) вычисляли по формуле (кг)/рост (м2)). Для классификации категории массы тела использовали таблицу сигмальных отклонений ИМТ CDC (The centers for Disease Control and prevention, США). Нормальным считали ИМТ между 15-м и 85-м перцентилем, при ИМТ от 85 до 95-го перцентиля – оценивали как избыточную, свыше 95-го перцентиля – как ожирение.

ДНК исследования. Геномная ДНК была получена из периферийного лейкоцитов крови. Полиморфизм LEPR Gln223Arg был проанализирован с помощью полимеразной цепной реакции, длина изучаемого фрагмента полиморфизма ограничивалась с помощью нижеописанных пар праймера [3, 7]. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) выделяют фрагменты цепочки ДНК с полиморфизмом (PCR-RFLP), используя созданный для данной процедуры специальный набор «FlexiGene DNA kit» (Qiagen, Hilden, Germany).

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают «праймеры» – синтетические олигонуклеотиды длиной 15–20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК – двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25–35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами.

Для анализа полиморфизма LEPR Gln223Arg использовались следующие праймеры:

Прямой праймер – 5′-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3′

Обратный праймер – 5′-AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3′

Продукты ПЦР визуализируются на 2%-м геле агарозы, содержащем этидиум бромид. Аллели были визуализированны с помощью электрофореза через агарозный гель, содержащий 2,5 % этидиум бромид.

Математико-статистическая обработка полученных результатов. Математикостатистическую обработку полученных данных осуществляли с применением компьютерных программ: Microsoft Office Excel 2010, Statistica 6.0. Определялась среднеарифметическая величина (М), стандартное отклонение (сигма) и стандартную ошибку среднего (m).

Уровень р менее 0.05 считался статистически значимым. Критерии Манна-Уитни и Хи-квадрат использовались для сравнения независимых групп. Коэффициент корреляции Пирсона использовался, чтобы исследовать эффекты независимых переменных от зависимой переменной.

Результаты. Группы с ИМТ < 85-го ПЦ и ИМТ ≥ 85-го ПЦ не отличались по возрасту и росту, уровнем общего ХС, ЛПНП и глюкозы. Однако другие антропометрические индексы (масса тела, ИМТ, SD ИМТ, ОТ, ОБ, индексы ОТ/рост, ОТ/ОБ), а также САД, ДАД, ТГ, уровни инсулина, индекс HOMA1R) оказались достоверно выше в исследуемой группе (ИМТ ≥ 85-го ПЦ, а уровень ЛПВП ниже (табл. 1).

Таблица 1

Антропометрические и биохимические показатели детей с ИМТ < 85-го и ИМТ ≥ 85-го процентиля

Показатель	Контрольная группа (дети с нормальной массой тела)	Группа исследования (дети с метаболическим синдромом)	р
Количество	25	100
Возраст, годы	13,83±1,01	13,91±0,98	0,541
Рост, см	163,06± 9,1	169,22±7,04	0,108
Масса тела, кг	52,59±4,56	79,38±8,9	<0,001
ИМТ, кг/м2	17,19±1,34	24,78±1,57	<0,001
SD ИMT	– 0,11±0,83	2,12±0,63	<0,001
ОТ, см	67,5±7,94	78,9±10,7	<0,001
ОБ, см	89,34±7,9	96,57±7,8	<0,001
Индекс ОТ/рост	0,48±0,06	0,58±0,07	<0,001
Индекс ОТ/ОБ	0,79±0,06	0,89 ±0,06	<0,001
САД, мм рт.ст.	110,09±6,9	119±9,11	0,008
ДАД, мм рт.ст.	68±5,87	76±7,71	0,003
Общий ХС, ммоль/л	4,42±0,58	4,52±0,77	0,792
ХСЛПНП, ммоль/л	2,46±0,72	2,85±0,75	0,773
ХСЛПВП, ммоль/л	1,55±0,17	1,18 ±0,12	0,001
ТГ, ммоль/л	0,60 (0,5; 1,15)	0,90 (0,6; 1,23)	0,003
Глюкоза, ммоль/л	5,18±0,67	5,09±0,77	0,350
Инсулин н/т, мкЕД/мл	8,11±2,12	13,19 (9,96; 17,76)	<0,001
HOMAIR	1,79±0,72	2,88 (1,94; 3,94)	<0,001

В настоящем исследовании у детей с абдоминальным ожирением был достоверно выше уровень факторов риска метаболических нарушений и инсулинорезистентности (ТГ, инсулин, HOMAIR) и ниже уровень холестерина ЛПВП; другие факторы риска ССЗ (САД и ДАД) также были выше в группе с абдоминальным ожирением. Таким образом, даже у детей школьного возраста с абдоминальным ожирением уже проявляются факторы риска ССЗ, присущие взрослой популяции.

При проведении генетического анализа проводилась сравнительная оценка антропометрических и биохимических показателей в соответствии с уровнем лептина и генетической мутации в гене рецептора лептина.

Антропометрические и биохимические показатели отражены в таблице 1.1. Уровень лептина в сыворотке крови был значительно выше в группе детей с ожирением, чем в контрольной группе (р < 0,01), также была отмечена значительная разница в группе с ожирением в сравнении с группой с нормальным весом в уровне глюкозы, инсулина, триглицеридов, ИМТ (р < 0,01).

Таблица 1.1

Сравнение антропометрических, биохимических показателей среди детей с нормальной массой тела и ожирением

Параметры	Нормальный вес	Ожирение	р
Лептин, нг/мл	6,2 (2,2–32,3)	11,4 (2,9 – 36,8)	<0,001**
Глюкоза, ммоль/л	4,6 (3,7 – 6,3)	5,3 (3,9 – 7,4)	<0,001**
Инсулин, мкЕД/мл	8,11±2,12 (5,99 – 10,23)	13,19 (9,96; 17,76)	<0,001**
ИМТ, кг/м2	17,19±1,34	24,78±1,57	<0,001**
Триглицериды, ммоль/л	0,60 (0,5; 1,15)	0,90 (0,6; 1,23)	<0,001**

Примечание: уровень значимости ** = p < 0,01 (критерий Манна-Уитни).

Оценка ассоциации мононуклеотидного полиморфизма LEPR Gln223Arg (SNPs) с уровнем лептина и метаболическими показателями была проведена с помощью мультифактори-ального анализа. Была выявлена значимая ассоциация полиморфизма LEPR Gln223Arg с уровнями лептина и глюкозы крови; результаты показаны в таблице 1.2.

Таблица 1.2

Доказанное положительное соотношение для LEPR Gln223Arg полиморфизма с уровнем лептина и другими метаболическими факторами

Показатели	LEPR Gln223Arg	р
Глюкоза	1,047 (1,004–1,092)	0,033*
Инсулин	1,016 (0,997–1,056)	0,099
Лептин	1,192 (1,038–1,379)	0,009**
Триглицериды	0,999 (0,993–1,004)	0,635

Примечание: уровень значимости:* = p < 0,05, ** = p < 0,01.

Распределение мононуклеотидного полиморфизма LEPR Gln223Arg соответствовало закону популяционной генетики Харди-Вайнберга (Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)) согласно критерию Хи-квадрат (χ2) и степени свободы (degrees of freedom) показаны в таблице 2.

Результаты по частоте генотипических и аллельных полиморфизмов LEPR Gln233Arg при ожирении и в контрольной группе также показаны в таблице Table 2. Отмечались значимые различия по частоте встречаемости генотипических и аллельных полиморфизмов LEPR Gln233Arg в группе с ожирением и контрольной группе (p < 0,05). Взаимосвязь между полиморфизмом LEPR Gln233Arg и выявленных нарушений при ожирении показана в таблице 3.

Таблица 2

Распределение генотипическое и аллельное полиморфизма LEPR Gln233Arg в обоих группах

LEPR Gln233Arg	Ожирение, n (%)	HWE, ожирение, р**	Нормальный вес, n (%)	HWE, нормальный вес, р*	Генотипический или аллельный р***
Генотип
Arg/Arg	20 (12,5)	0.399	17 (10,5)	0,295	0,044*
Arg/Gln	80 (50,0)	(df = 1)	62 (38,3)	(df = 1)
Gln/Gln	60 (37,5)	(χ2 = 0,71)	83 (51,2)	(χ2 = 1,09)
Аллели
Arg	120	(0,375)	96	(0,296)	0,034*
Gln	200	(0,625)	228	(0,704)

Примечание: Significant level;* = p < 0,05.

** Основан на результатах Хи-квадрат теста.

*** Основан на результатах сравнения по Хи-квадрат тесту в группе с ожирением и контрольной группой.

Таблица 3

Взаимосвязь между полиморфизмом LEPR Gln233Arg и ожирением

LEPR Gln233Arg полиморфизм; генотип	Ожирение	Нормальный вес	p**
Gln/Arg + Arg/Arg	100 (62,5)	79 (48,8)	0,013*
Gln/Gln	60 (37,5)	83 (51,2)

Примечание: уровень значимости равен p < 0,05.

Доказана значимая связь полиморфизма LEPR Gln223Arg с ожирением (OR = 1,8, p < 0,05), а генотипы Gln/Arg с Arg/Arg выявлены в группе с ожирением в 62,5 % случаев, и 48,8 % в группе с нормальным весом (p > 0,05).

Выводы. 1. Ключевым моментом исследования было то, что уровень лептина значительно выше в группе детей с ожирением, чем в контрольной группе, а полиморфизм LEPR Gln223Arg взаимосвязан с концентрацией лептина и ожирением среди детей. А ожирение один из значимых факторов риска кардиоваскулярных заболеваний и диабета 2-го типа [7].

• 2.    Доказано, что одним из факторов, способствующего развитию ожирения, является генетический. Механизмы развития ожирения и метаболического синдрома, однако, досконально не выяснены. Продолжающиеся исследования в этой сфере медицины и эндокринологии доказывают актуальность этой проблемы.

• 3.    Лептин, как сигнальный фактор, вырабатываемый адипоцитами играет важную роль в метаболическом контроле, такую как усвоение глюкозы крови тканями, окисление жиров и сокращение потребляемой пищи [8, 11]. Наше исследование доказало связь полиморфизма LEPR Gln223Arg с повышенным уровнем глюкозы, лептина, что ведет к высокому риску реализации метаболического синдрома. Предыдущие исследования также докладывали о взаимосвязи полиморфизма LEPR с метаболизмом глюкозы [12] и инсулинорезистентностью [10].

• 4.    Наличие генетического полиморфизма в гене LEPR Gln223Arg влияет на уровень лептина в крови и это может играть значительную роль в этиологии метаболических нарушений, в том числе и среди самарских детей. Более того, дальнейшее исследование генетических нарушений поможет в развитии превентивной стратегии в отношении ожирения и его осложнений, а также роль других генетических факторов и факторов окружающей среды должна быть тщательно изучена в отношении детской популяции г. Самара.