Геноидентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан

Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад ВЛКРС являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [3, 4].

Вопросы генодиагностики лейкоза крупного рогатого скота в контексте изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма актуальны, учитывая факт невозможности типизации данного вирусного патогена серологическими методами исследования [4].

Цель настоящей работы – филогенетический анализ изолятов ВЛКРС, выявленных в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан на предмет их таксономической классификации и совершенствование способов генотипической идентификации BLV по локусу env -гена.

Материалы и методы. При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env -гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 3].

Секвенирование продуктов амплификации локуса env -гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» проведено на приборе ABI-300.

Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355), «N28» (GenBank A/N: HM102356), «N72» (GenBank A/N: JF683619) и «N174» (GenBank A/N: JF713455) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env -гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST, CLUSTAL W (v. 1.83) и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.

Эндонуклеазы рестрикции, отобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII , SspI , HphI , HaeIII , BstYI .

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Результаты исследования и их обсуждение. По результатам филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env -гена типовых представителей известных генотипов ВЛКРС было установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе Республики Татарстан, принадлежал к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах Республики Татарстан, относились к 4-му генотипу BLV (рис. 1).

¹ BG (EF065638) ----------- [N72 (JF683 619)] 4-2 (IIM563781)

— 151 (AY 185360)

50(DQ059421)

---------PL-1238 (FJ8O8582)

-------------12 (S83530)

-----CROC (EF065639)

'---CRAS-2 (EFO65636)

---------CRLC-1 (EF065655)

---------- |N28 (HM 1023 56)| ---- 1 (AY5I5280)

------14 (AY515274)

■---USCA-1 (EF065647)

J । USCA-2 (EFO65648) ।----------JPFU (EF065650) _

---AL-1453 (FJ808577)

— PL-4960 (FJ808590)

AL-164(FJ808574)

ARGSF8 (AF 485773) . — |N 174 (JF713455)|

30(DQ059417)

. ---3-43 (HM563767)

_--4-1 (HM563766)

ELG СГО/МП7109 (JN990073)

M1 /ELG Cro/08 (GLI724606)

ELGCro.BEM08(JN990069)

ELG CroA)SAO8 (JN990070) ----------ELG Cro/ORAW (JN99007I)

^L । --ELG CroA'RAW (JN99O072)

------ VdM (М3 5239)

-----Cow 527 (AFQ07764)

---------23 (U87873)

;---AL-63 (FJ8O857I)

__________IAL-2106 (FJ808578)

'-------LlniC'0611 (FM955558)

ELGCro'BlO/lO (JN990074) ---------------------------Kurdistan (EU266062) “

Рис. 1. Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV (env-ген)

[MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 40 seq.]

Также выявленный в Дрожжановском районе Республики Татарстан другой уже изолят «N174» характеризовался признаком нового, ранее не обоснованного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входили на момент обоснования нами нового генотипа BLV близкородственные изоляты «4-1» и «3-41», выявленные в Украине, а также изолят «M1/ELG_Cro/08», обнаруженный в Хорватии (рис. 1.)

Необходимо отметить, что факт существования обоснованного нами нового генотипа BLV [1] чуть позже был подтвержден Хорватскими исследователями [2].

В процессе системного анализа рестрикционных картирований локуса   env-гена   известных представителей BLV, в рамках совершенствования схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВЛКРС, нами были подобраны новые условия идентификации по 5 эндонуклеазам рестрикции: PvuII, SspI, HphI, HaeIII и BstYI.

Для исчерпывающей же идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной env -ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по локусу env -гена.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Шаева А.Ю, Гараева З.Р., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Алимов Н.З. Идентификация нового генотипа ВЛКРС // Ученые записки КГАВМ, 2012 г., Т. 211. – С. 192-197. 2. Balic D., Lojkic I., Periskic M., Bedekovic T., Jungic A., Lemo N., Roic B., Cac Z., Barbic L., Madic J. Identification of a new genotype of bovine leukemia virus // Arch. Virol., 2012. –Apr 10 [Epub ahead of print]. 3. Beier D., Blankenstein P., Marquardt O., Kuzmak J. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., 2001, V. 114. – N. 7-8. – P. 252-256. 4. Moratorio G. Obal G., Dubra A., Correa A., Bianchi S., Buschiazzo A., Cristina J., Pritsch O. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes // Arch. Virol., 2010. – V. 155. – N. 4. – P. 481-489.

ГЕНОИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВЛКРС, ВЫЯВЛЕННЫХ В ЖИВОТНОВОДЧЕСКИХ ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Закирова З.Р.

Резюме

На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей     локуса     env-гена     провируса     BLV геноидентифицированы изоляты ВЛКРС, выявленные на территории Республики Татарстан.

VL CATTLE ISOLATES GENE IDENTIFICATION IN FARMS OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN

Zakirova Z.R.