Генотипирование герпесвирусов крупного рогатого скота на основе однонуклеотидных полиморфизмов и полногеномного сиквенса

Вирус герпеса крупного рогатого скота 1-го типа (BоAHV1, по современной классификации Varicellovirus bovinealpha1) — один из основных патогенов, поражающих крупный рогатый скот во всем мире и вызывающий как респираторные, так репродуктивные патологии, включая аборты и бесплодие у коров. У вируса выделено три подгруппы (1.1, 1.2а, 1.2b), неодинаково распространенные в мире. Вирус герпеса крупного рогатого скота 5-го типа (BоAHV5, Varicellovirus bovinealpha5), ранее относившийся к BоAHV1, распространен преимущественно в Южной Америке. BоAHV1 и BоAHV5 вызывают заболевания, сходные по клиническим признакам, и остаются предметом пристального внимания. Особенно актуально изучение распространения и частоты выявления этих агентов и их генетических подгрупп. В настоящей работе впервые установлено генетическое разнообразие герпесвирусов, циркулирующих в популяции крупного рогатого скота на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Были дифференцированы 22 штамма и изолята герпесвирусов крупного рогатого скота (BоAHV1 и BоAHV5). Показано наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических типов и подтипов BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b), а также изолятов, принадлежащих к BоAHV5. Целью работы было генотипирование штаммов и изолятов герпесвирусов крупного рогатого скота, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации, при помощи полногеномного сиквенса и поиск однонуклеотидных полиморфизмов для определения генетических подгрупп. Работу проводили в 2022-2025 годах в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, в ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора и в ФГБНУ Федеральный научный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко. Объектами исследования были 21 штамм и изолят BоAHV1, выделенные на территории бывшего СССР и Российской Федерации в период 1969-2004 год, а также вакцинный штамм ТК-А(ВИЭВ)В2, входящий в состав живых вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, длительное время применявшихся в нашей стране для специфической профилактики болезни. Все агенты перед секвенированием прошли три пассажа в культуре клеток MDBK на среде Игла МЕМ с глутамином и добавлением 5 % эмбриональной сыворотки и антибиотиков. Нуклеиновые кислоты экстрагировали с использованием набора лабораторных реагентов для выделения общей ДНК QIAamp DNA Mini Kit (250) («Qiagen», США). Элюцию ДНК с мембраны проводили буфером ТЕ. Концентрацию полученной ДНК измеряли с помощью Qubit 3.0 с применением набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и затем использовали для подготовки библиотек NGS методом лигирования Y-образных адаптеров («Illumina, Inc.», США). Секвенирование осуществляли на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с использованием набора для секвенирования MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles) («Illumina, Inc.», США). Анализ последовательностей фрагментов вируса проводили при помощи пакета MIRA (v.4.9.6), BWA (BurrowsWheeler Aligner) (v.0.7.15), IGV (v.2.3.78), Samtools (v.1.3.1), GenomeAnalysisTK (v.3.6) (22). Полногеномные последовательности выравнивали при помощи Ugene (v.1.24.1) с использованием алгоритма MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform) (v7.407) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2). Выравнивание последовательностей генов и поиск сайтов для ре-стриктаз проводили в программе Mega 7 по последовательности штамма Cooper (KU198480.2) в соответствии с информацией о последовательности генов, представленных в GenBank. Построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 7. Филогенетический анализ осуществляли методом ближайших соседей (Neighbor-Joining method), матрицу генетических расстояний рассчитывали методом минимальной эволюции. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов на сайтах рестрикции HPA I, Sac II, Hind III на участках генов UL28, US3 и UL39, а также филогенетический анализ генов US8 и UL27 показали наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических групп BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b). На основе выявленных SNP в секвенированных последовательностях были выделены следующие группы: тип 1.1. — 7 последовательностей BоAHV1, субтип 1.2а — 4 последовательности BоAHV1, субтип 1.2b — 3 последовательности BоAHV1, тип 1.3 — 8 последовательностей BоAHV5, включая

Вирус герпеса крупного рогатого скота 1-го типа (син. вирус инфекционного ринотрахеита, Bovine alphaherpesvirus 1 , BоAHV1) — крупный оболочечный ДНК-содержащий вирус, относящийся к порядку Herpesvirales , семейству Orthoherpesviridae , подсемейству Alphaherpesvirinae , роду Varicello-virus , виду Varicellovirus bovinealpha1 (1). Геном вируса представлен линейной двухцепочечной ДНК размером 152-261 п.н., содержит 67 уникальных генов и 2 гена, дублированных в инвертированных повторах, которые кодирует не менее 69 протеинов (2). Это один из значимых возбудителей респираторной и репродуктивной патологий крупного рогатого скота (КРС), приводящих к значительным экономическим потерям в животноводстве (3, 4).

По существующей классификации все штаммы этого вируса подразделяют на две генетические группы — тип 1.1 и тип 1.2. Штаммы, принадлежащие к типу 1.1, связаны с респираторными и репродуктивными заболеваниями, распространенными в Европе, Северной и Южной Америке. Вирусы типа 1.2 делятся на две подгруппы. Штаммы подгруппы 1.2a наиболее распространены в Бразилии и ассоциируются с респираторными и репродуктивными заболеваниями. Штаммы подгруппы 1.2b обладают более низкой вирулентностью, чем штаммы подгруппы 1.1, и встречаются в Европе, США и Австралии (5). В последнее время на основании анализа последовательностей гена гликопротеина B была выделена подгруппа штаммов 1.2с (6).

Ранее штаммы, обладавшие значительными отличиями рестрикционного профиля, способные вызывать менингоэнцефалит и респираторную болезнь у КРС, были объединены в подгруппу 1.3. Позднее их выделили в отдельный вид Bovine alphaherpesvirus 5 (BоАHV5, по современной классификации Varicellovirus bovinealpha 5 ), распространенный преимущественно в регионе Южной Америки и в некоторых других странах (7-9). В настоящее время штаммы и изоляты BоAHV5 условно разделены на три подгруппы: a, b и c (10) . Подгруппа a включает несколько бразильских изолятов и австралийский штамм N569, подгруппа b — аргентинский изолят A663, а нетипи-руемые изоляты отнесены к подгруппе c (11).

Во всем мире для контроля заболевания применяются живые или инактивированные вакцины, а также вакцины, основанные на стратегии DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals, дифференциация инфицированных от вакцинированных животных), при производстве которых применяют штаммы с делетированными белками-иммуногенами. Чаще для этого используют штаммы BоAHV1 подгруппы 1.1 (12). По мнению некоторых авторов, аттенуированные вакцинные штаммы могут распространяться в стаде животных наряду с полевыми и иногда вызывать клинические признаки болезни (13).

В Российской Федерации длительное время с положительным эффектом применяли живые вакцины из аттенуированного штамма ТК-А(ВИЭВ)В2, который на основании рестрикционного анализа тотальной ДНК был отнесен к подгруппе 1.3 (14). Предположительно в популяции животных могут циркулировать штаммы, родственные этому вакцинному 674

штамму, поэтому проблема дифференциации вакцинных и полевых штаммов вируса актуальна во всем мире (15).

Для генетической дифференциации штаммов применяются различные методы.

A.E. Metzler с соавт. (16) в 1983 году разработали методику рестрикционного анализа тотальной ДНК рестриктазой Hind III, которая позволила разделить штаммы BоAHV1 на подтипы 1.1, 1.2a, 1.2b и 1.3. Этот метод лег в основу современной классификации вируса (16). Однако эта методика требует наработки большого количества вирусной ДНК, что ограничивает ее использование. S.S. Maidana с соавт. (17) модифицировали эту методику за счет использования ПЦР-ПДРФ анализа на основе этого же фермента ампликонов двух генов — US3 и UL39 для дифференциации подтипов 1.1, 1.2a, 1.2b непосредственно в пробах биоматериала от больных животных. В России подобная методика была предложена Е.В. Жираковской с соавт. (18) в 2004 году и использовалась для классификации отечественных штаммов вируса А.Г. Глотовым с соавт. (19). Метод основан на рестрикции ампликона гена UL27 рестриктазами HPA I и Sac I, что позволяло выявлять группы штаммов, сходных по профилям рестрикции — Cooper-подобные (тип 1.1), ТК-подобные (1.2а/b) и ТК-А-подобные (1.3).

Методы секвенирования нового поколения, такие как NGS (Next Generation Sequencing), относительно недороги, менее трудоемки и обеспечивают надежный анализ ДНК (20). Они позволяют выявлять однонуклеотидные замены SNP в генах, что дает возможность кластеризовать штаммы, дифференцировать вакцинные и полевые штаммы, а также выявлять рекомбинации между ними (5, 21). Известно, что рекомбинации могут привести к созданию новых вирусных форм со специфическими патогенными характеристиками (11) .

Данные по филогенетическому анализу герпесвирусов крупного рогатого скота в нашей стране фрагментарны.

В настоящей работе впервые установлено генетическое разнообразие герпесвирусов, циркулирующих в популяции крупного рогатого скота на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Были дифференцированы 22 штамма и изолята герпесвирусов крупного рогатого скота (BoAHVI и BoAHV5) . Показано наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических типов и подтипов BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b), а также изолятов, принадлежащих к BоAHV5.

Целью работы было генотипирование штаммов и изолятов герпесвирусов крупного рогатого скота, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации, при помощи полногеномного сиквенса и поиск однонуклеотидных полиморфизмов для определения генетических подгрупп.

Методика. Работу проводили в 2022-2025 годах в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, в ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора и в ФГБНУ Федеральный научный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко.

Объектами исследования были штаммы и изоляты BоAHV1 в количестве 21, выделенные в СССР и Российской Федерации в период 19692004 год, а также вакцинный штамм ТК-А(ВИЭВ)В2, входящий в состав живых вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, длительное время применявшихся в нашей стране для специфической профилактики болезни. Все 22 штамма и изолята герпесвирусов были выделены из клинических образцов в первично-трипсинизированных культурах клеток ПЭК (почка эмбриона коровы), ТБ (тестикулы бычка), пассировались в перевиваемой линии культуры клеток почки крупного рогатого скота MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) и хранились в лиофилизированном состоянии или при -80 °С.

Все агенты перед секвенированием прошли три пассажа в культуре клеток MDBK на среде Игла МЕМ (Minimum Essential Medium) с глутамином и добавлением 5 % эмбриональной сыворотки и антибиотиков. Для выделения ДНК использовали штаммы и изоляты в концентрации не ниже 10^4,75 lg ТЦД 50/0,1 мл . На последнем пассаже инфицированные клетки подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию, супернатант центрифугировали при 16500 об/мин в течение 90 мин при 4 ° C в настольной центрифуге Beckman Coulter Allegra X-30R («Beckman Coulter», США). После центрифугирования среду медленно удаляли. Осадок вируса ресуспендиро-вали в 1000 мкл среды Игла MEM и использовали для выделения ДНК.

Нуклеиновые кислоты экстрагировали с использованием набора лабораторных реагентов для выделения общей ДНК QIAamp DNA Mini Kit (250) («Qiagen», США). Элюцию ДНК с мембраны проводили буфером ТЕ (Трис, Tris, — буферный агент, ЭДТА, EDTA, — хелатирующий агент). Концентрацию полученной ДНК измеряли с помощью Qubit 3.0 с применением набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и затем использовали для подготовки библиотек NGS.

Для подготовки библиотек применяли метод лигирования Y-образных адаптеров («Illumina, Inc.», США). Секвенирование осуществляли на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с использованием набора для секвенирования MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles) («Illumina, Inc.», США).

Анализ последовательностей фрагментов вируса проводили при помощи пакета MIRA (v.4.9.6), BWA (Burrows-Wheeler Aligner) (v.0.7.15), IGV (v.2.3.78), Samtools (v.1.3.1), GenomeAnalysisTK (v.3.6) (22). Полногеномные последовательности выравнивали при помощи Ugene (v.1.24.1) с использованием алгоритма MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform) (v7.407) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2).

Выравнивание последовательностей генов и поиск сайтов для ре-стриктаз проводили в программе Mega 7 по последовательности штамма Cooper (KU198480.2) в соответствии с информацией о последовательности генов, представленных в GenBank.

Построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 7. Филогенетический анализ осуществляли методом ближайших соседей (Neighbor-Joining method) (23), матрицу генетических расстояний рассчитывали методом минимальной эволюции (24).

Результаты. Описание и депонированные последовательности геномов 22 штаммов и изолятов герпесвирусов, использованных в настоящей работе, представлены в таблице.

Штаммы и изоляты вирусов герпеса крупного рогатого скота 1-го и 5-го типов, выделенные в период с 1969 по 2004 годы на территории бывшего СССР и Российской Федерации

Название	Регион, год выделения	Форма заболевания	Номер в GenBank
Штаммы

ТНЛ        Тамбовская область, референтный штамм, 1974 год       Респираторная      PX910669

ТК          Тамбовская область, референтный штамм, 1969-1970 годы Респираторная      PX910674

ТК-А        Искусственно аттенуированный, 70-е годы               Вакцинный         PX910675

((ВИЭВ)В2)

Продолжение таблицы

А(V-339)	Кемеровская область, 2000 год	Генитальная, влага-	PX910672
М40(М-40)	Венгрия, 70-е годы, в РФ с 1979 года	лищные выделения Генитальная	PX910668
Оренбург	Референтный штамм, 1979 год	Респираторная	PX910661
М-29	Венгрия, 70-е годы, в РФ с 1979 года, референтный штамм Респираторная		PX910662
С-2 (Саратов) Саратовская область, референтный штамм, 1978 год		Генитальная	PX910673
Я99	Ярославская область, референтный штамм, 1979 год	Респираторная	PX910671
М	Изоляты Тюменская область, 2002 год	Сперма, латентная	PX910664
МТ	Новосибирская область, 2002 год	Респираторная	PX910665
И1	Новосибирская область, 1999 год	Генитальная	PX910666
ПВ	Новосибирская область, 2002 год	Нервная	PX910667
С15	Тюменская область, 2003 год	Сперма, латентная	PX910670
Д	Алтайский край, 2001 год	Респираторная	PX910676
С1	Кемеровская область, 2003 год	Сперма, латентная	PX910677
С4	Кемеровская область, 2003 год	Сперма, латентная	PX910678
С11 (V-337)	Тюменская область, 2003 год	Сперма, латентная	PX910679
КМ	1982 год	Нервная	PX910680
МС (MOC)	Московская область, 2004 год	Сперма, латентная	PX910681
СО-10	Омская область, 2003 год	Сперма, латентная	PX910682
ЛК	Кемеровская область, 2002 год	Генитальная	PX910663

Примечание. Штамм А, а также изоляты Д и С11 депонированы в НИИ Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор» в 2004 году.

IIPAI 55013-55018

Sac II 55146-55151

1 Туре 1.1

2 KU198480.2 Strain Cooper BoHV	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
3 MH724208 1 isolate BoviShield Gold FP5	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CGG	CCGCGGGGGGC
4 MF421714 1 Strain Los Angeles	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
5 Strain Orenburg	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
6 Strain M-29	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
7 isolate LK	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
8. isolate M	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CGG	CCGCGGGGGGC
9. isolate MT	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
10 isolate N1	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
11 isolate PV	A C	С T AG	TTAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
12. Type 12
13 KM258880 1 Strain K22	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
14 KM258882 1 Strain SM023	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
15. KM258883.1 Strain SP1777	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
16. Strain TNL	A C	С т c G	TCAACGGGCC	G G CGG	CCGCGGGGGGC
17. Strain A	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
18. Strain C-2	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
19 Strain TK	A C	С T C G	TCAACGGGCC	G G C G G	CCGCGGGGGGC
20. Strain M40	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
21 isolate C15	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
22. isolate Ja99	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	CCGCGGGGGGC
23. Type 1.3
24. AY261359.1 Strain SV507/99	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
25. KY549446.1 Strain ISO 97/45	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	G G G G G C
26. MZ420492.1 Strain 674/10	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
27 KY549446 1 Strain ISO 97/45	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	G G G G G C
28. Strain TK-A	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
29 Isolate KM	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G C G G	С C G C	A	GGG GG C
30. isolate C1	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CGG	С C G C	A	G G G G G C
31. isolate C4	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
32. isolate CO10	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
33. isolate C11	A C	С T CG	TCAACGGGCC	GGCGG	С C G C	A	GGG GG C
34 isolate D	A C	С T CG	TCAACGGGCC	G G CG G	С C G C	A	GGG GG C
35 isolate MC	A C	С T CG	TCAACGGGCC	GGCGG	С C G C	A	GGG GG C

Рис. 1. Сайты рестрикции в гене UL28 у штаммов и изолятов вирусов герпеса крупного рогатого скота 1-го и 5-го типов, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Нумерация последовательностей дана согласно штамму Cooper (KU198480.2). Желтым цветом выделены сайты расщепления рестриктазами HPA I и Sac II, красной рамкой выделены однонуклеотидные замены на этих сайтах у разных типов изолятов.

Подтипы секвенированных штаммов и изолятов вирусов определяли на основе наличия SNP на сайтах рестрикции. Сначала анализировали се-квенированные геномы на наличие сайтов рестрикции ферментами HPA I и Sac II на участке гена UL28 (DNA packaging terminase subunit 2) размером 460 п.н. (18) (рис. 1).

В соответствии с методикой исследования все штаммы и изоляты разделились на три группы: первая включала тип 1.1 — наличие сайтов рестрикции рестриктаз HPA I, Sac II; вторая тип 1.2 — наличие сайта рестрикции только рестриктазы Sac II; третья тип 1.3 — отсутствие сайтов рестрикции рестриктаз HPA I, Sac II.

По результатам анализа к типу 1.1 отнесли штаммы Оренбург, М29, изоляты ЛК, М, Н-1, ПВ, МТ. К типу 1.2 принадлежали штаммы и изоляты ТНЛ, ТК, М40, Я99, С15, С-2, А. Группа типа 1.3, или BоAHV5, включила штамм ТК-А и изоляты Д5, С1, СО10, С11, МС, С4, КМ.

Методика S.S. Maidana с соавт. (17) позволила разделять штаммы и изоляты BоAHV1 на субтипы на основании наличия сайта рестрикции фермента Hind III на участках двух генов US3 (serine/threonine protein kinase) и UL39 (ribonucleotide reductase subunit 1), ограниченных соответствующими праймерами. При этом штаммы субтипа 1.2b содержали этот сайт, штаммы субтипа 1.2а включали сайт только в гене US3 , а штаммы субтипа 1.1 не содержали указанных сайтов (рис. 2).

UL39                         US3

25125-25141

114277

-114292

1 Subtype 1.1

.....

-

2. KU198480 2 Strain Cooper

CGG

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CGG С A A

C

G

c

T

T A A G

T A

3. MF421714.1 Swain Los Angeles

C G G

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CGG С A A

C

G

c

T

T A A G

T A

4 PQ044366 1 isolate Moscow

C G G

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

5. Strain Orenburg

C G G

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

6 Strain M-29

C G G

T

T G A A G C

T

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

7. Isolate M

C G G

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

8. Isolate MT

CGG

T

T G A A G

C

T

c

T G G A A

CG G C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

9 Isolate N1

C G G

T

T G A A G

C

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

10. Isolate LK

C G G

T

T G A A G

C T

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

11 Isolate PV

C G G

T

T G A A G

C ■

c

T G G A A

CGG C A A

C

G

c

T

T A A G

T A

12 Subtype 1 2a

.....

-

13 MN239798 1 isolate ST

C G G

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

14 Strain M40

C G G

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

15 Strain TNL

C G G

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

16 Isolate Ja99

C G G

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

17 Isolate C15

C G G

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

18 Subtype 1 2b

.....

19 KM258880 1 Strain K22

C G G

T

T G A A G

c

T

T

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

20 KM258883 1 Strain SP1777

C G G

T

TGAAG

c

T

T

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

21 Strain A

C G G

T

T G A A G

c

T

T

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

22 Strain C-2

CGG

T

T GA AG C

T

T

T G G A A

CGGCGAAGC

T

T A A G

T A

23. Strain TK

C G G

T

T G A A G C

T

T

T G G A A

CGGCGAAG

c

T

T A A G

T A

24 Subtype 1 3 (BHV-5)

.....

-

25. KY549446 1 Strain ISO 97/45

CGG

T

T G A A G C

T

c

T G G A A

T GG T G A

G

G C

T

T A A G

T A

26 0 0608621 1 isolate S103

CGG

T

T G A A G C

T

c

T G G A A

T GG T G A

G

G

c

T

T A A G

T A

27 Strain TK-A

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

T GG T G A

G

G

c

T

T A A G

T A

28 Isolate KM

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

T GG T G A

G

G

c

T

T A A G

T A

29 Isolate MC

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

T G G T G A

G

G

c

T

T A A G

T A

30 Isolate C11

CGG

T

T G A A G C

T

c

T G G A A

T GG T G A

G

G

c

T

T A A G

T A

31. Isolate CO10

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGG C A A

G

G

c

T

T A A G

T A

32 Isolate D

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGG C A A

G

G

c

T

T A A G

T A

33 Isolate C1

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGG C A A

G

G

c

T

T A A G

T A

34 Isolate C4

CGG

T

T G A A G

c

T

c

T G G A A

CGG CA A

G

G

c

T

T A A G

T A

Рис. 2. Сайты рестрикции Hind III в генах UL39 и US3 у штаммов и изолятов вирусов герпеса крупного рогатого скота 1-го и 5-го типов, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Нумерация последовательностей дана согласно штамму Cooper (KU198480.2). Желтым цветом выделен сайт рестриктазы Hind III, красной рамкой выделены однонуклеотидные замены в гене UL39 , синей рамкой — в гене US3 .

На основании наличия или отсутствия сайтов рестрикции все секве-нированные штаммы и изоляты были разделены нами на 4 группы: тип 1.1 включал штаммы Оренбург, М-29, изоляты ЛК, М, Н-1, ПВ, МТ. Тип 1.2 был разделен на 2 субтипа: штаммы и изоляты ТНЛ, М40, Я99, С15 были отнесены к субтипу 1.2a, а штаммы и изоляты ТК, С-2, А — к субтипу 1.2b. У штаммов и изолятов ТК-А, С1, С4, С11, D, СО10, КМ и МС отсутствовали сайты расщепления рестриктазой Hind III, а в гене US3 была выявлена 678

однонуклеотидная делеция А415G, специфичная для BоAHV5 .

Для подтверждения полученных результатов провели филогенетический анализ по полным последовательностям генов US8 (гликопротеин Е) и UL27 (гликопротеин В). В GenBank представлены полные последовательности BоAHV1 типа 1.1, субтипа 1.2b, BоAHV5, но только фрагментарная последовательность из отдельных генов штамма ST субтипа 1.2a, из которых ген US8 (Z23068.1) имеет наибольшие размеры. Филогенетический анализ по этому гену позволяет подтвердить результаты субтипирования полученных последовательностей.

Гликопротеин B (gB) BоAHV1 — главный белок-иммуноген оболочки вируса и ключевая мишень для вируснейтрализующих антител. Его высоконсервативный ген UL27 часто используется для генетической идентификации различных штаммов вируса. Его последовательности наиболее полно представлены в GenBank, за исключением субтипа 1.2a, поэтому лучше всего подходят для филогенетического анализа.

Результаты филогенетического анализа по полной последовательности гена US8 (гликопротеин Е) подтвердили данные о разделении всех штаммов и изолятов на четыре группы.

пЧ

'2

-и

ф isolate LK ф isolate MK ф isolate M ф isolate N1 ф isolate PV ф Strain M-29 ф Strain Orenburg

AJ004801.1 type 1.1

MH724208.1 isolate BoviShicld Gold FPS MF421714.1 Strain Los Angeles KU198480.2; Strain Cooper

J     Ф isolate Ja99

• >    ф isolate CIS

• - ф Strain M40 ф Strain TNL

  -Z23068.I Strain ST _

  . -KM258880.1 Strain K22

KM258883.1 Strain SP1777

j KM258882.1 Strain SM023 ф Strain Al

’ ф Strain C-2 Ф Strain TK

-OP035381.1 type 1.2

1.2a

1.2b

1.1

BoAHVl

ф isolated ф isolate C4 ф isolate D ф Strain TK-A ф isolate MC

। ф isolate KM ф isolate CH

I ф isolate CO 10

• -    KY549446.1 Strain ISO 97/45 KY559403.2 Strain P160/96 MZ364295.1 Strain 166/84 MW829288.1 isolate A663 MZ420492.1 Strain 674/10 NC 005261.3 Strain CV507/99 PP897810.0 В о H V 5/C attle/India/2018/Bhilwara

• -    AFO3O027.1 EHV 4

5c

5b

5a

BoAHV5

0,10

Рис. 3. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей полного гена US8 (гликопротеин Е) штаммов и изолятов и вирусов герпеса крупного рогатого скота 1-го (BоAHV1) и 5-го (BоAHV5) типов, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации (использован метод ближайших соседей, статистическую достоверность топологии деревьев устанавливали с помощью бутстреп-теста). Исследованные штаммы и изоляты обозначены черными кружками.

Группы 1.1, 1.2а, 1.2b совпадали на 99-100 % с референтными штаммами BоAHV1. Штаммы из группы 1.3 (BoAHV5) на 92-93 % имели сходство с референсными штаммами BоAHV5 и на 89-90 % с референтными штаммами BоAHV1 (рис. 3).

Аналогичная картина была получена при секвенировании по гену гликопротеина B (рис. 4).

MF421714.1 Strain Los Angeles

AJ0O4801.1 type 1.1

KU198480.2: Strain Cooper

MH724208.1 isolate BoviShield Gold FPS

s%

100^2

Strain Orenburg

- ф Strain M-29 ф isolate PV S isolate M isolate N1

I ф isolate LK ф isolate MT ф Strain M40 ф Strain TNL ф isolate CIS ф isolate Ja99

KM258880.1 Strain K22

OP03538L1 type 1.2

1,2a

1.1

BoAlIVl

27 Ф Strain C 2

ф Strain Al ф Strain TK

1.2b

MZ420492.1 Strain 674/10

--- MW829288.1 isolate A663

5b

MZ364295.1 Strain 166/84

99 57

I— ф isolate D

L ф isolate Cl 72 г ф Strain TK-A 52 l ф isolate Cl 1

ф isolate KM ф isolate C4

! - ф isolate MC

L ф isolate CO10

'   1— KY549446.1 Strain ISO 97/45

100 [

- KY559403.2 Strain Pl60/96

' NC 005261.3 Strain CV507/99

AF07S726.2 Strain N565

5c

5a

BoAHV5

AF030027.1 EHV 4

0,050

Рис. 4. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей полного гена UL27 (гликопротеин В) штаммов и изолятов и вирусов герпеса крупного рогатого скота 1-го (BоAHV1) и 5-го (BоAHV5) типов, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации (использован метод ближайших соседей, статистическую достоверность топологии деревьев устанавливали с помощью бутстреп-теста). Исследованные штаммы и изоляты обозначены черными кружками.

Группы 1.1, 1.2а, 1.2b совпадали на 99-100 % с референтными штаммами BоAHV1. Последовательности, относящиеся к группе 1.3 (BoAHV5) были сгруппированы в отдельную кладу с BоAHV5а и BоAHV5с, но генетически различались между собой. Ни одна из последовательностей герпесвирусов этой группы не обладала 100 % сходством с вакцинным штаммом ТК-А. Некоторые штаммы, отнесенные к группе 1.3 (BoAHV5), были выделены до массового применения вакцины из штамма ТК-А и вызывали заболевание при экспериментальном введении телятам. Можно предположить, что они имеют естественное происхождение или возникли в результате мутаций вакцинного штамма ТК-А и полевых штаммов BоAHV1 (25-28).

Известно, что BоAHV1 и BоAHV5 — это генетически стабильные вирусы, хотя показано существование некоторых различий между изоля-тами, выделенными в разных странах, в различное время и при всевозможных клинических формах инфекции (5). Поэтому необходимы дальнейшие исследования всех полных геномов секвенированных вирусов для выявления рекомбинации, а также изучения изменений генома, которые могут повлиять на их вирулентность и иммуногенность или будут указывать на происхождение.

Попытки дифференцировать BoАHV1 и BoАHV5, а также выявлять их генетические подгруппы предпринимались ранее, однако их успех сдерживался трудоемкостью методик рестрикционного анализа, связанного с необходимостью наработки больших количеств вируса и выделения ДНК (28, 29). Прогресс в исследованиях оказался возможен после разработки метода ПЦР-ПДРФ анализа нуклеиновых кислот, однако такие работы стали более доступны с применением методов полногеномного секвенирования (30, 31).

Полученные результаты подтверждают наши более ранние исследования (32), свидетельствующие о неоднородности изолятов вируса, которые циркулируют в популяции крупного рогатого скота, и совпадают с данными зарубежных авторов, которые выявили одновременное присутствие BoАHV1 и BoАHV5, а также различных их генетических подгрупп у КРС (33-34).

В работе А.В. Пчельникова и соавт. (35) также показана возможность разделения штаммов и изолятов вируса на вакцинные, респираторные, генитальные и смешанные с использованием поиска однонуклеотидных полиморфизмов в контрольных точках генома вируса.

Таким образом, мы провели полногеномный сиквенс 22 штаммов и изолятов герпесвирусов (BоAHV1 и BоAHV5), выделенных в различные годы от крупного рогатого скота на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов на сайтах рестрикции HPA I, Sac II, Hind III на участках генов UL28 , US3 и UL39, а также филогенетический анализ генов US8 и UL27 показали наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических групп BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b). Восемь штаммов и изолятов были идентифицированы как BоAHV5, следовательно, нами впервые показано распространение этого типа вирусов в России. Поскольку ни одна из последовательностей BоAHV5 не имела 100 % сходства со штаммом ТК-А, а некоторые штаммы были выделены до массового применения вакцины из штамма ТК-А и вызывали заболевание при экспериментальном введении телятам, можно предположить, что они имеют естественное происхождение или возникли в результате рекомбинаций ТК-А и полевых штаммов BоAHV1. Полученные результаты показывают возможность использования методов секвенирования нового поколения для дифференциации штаммов и полевых изолятов герпесвирусов крупного рогатого скота и подтверждают правомерность существующей классификации вируса, основанной на рестрикционном анализе тотальной ДНК или ПЦР-ПДРФ анализе.

1 ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Бостока,