Генотипирование герпесвирусов крупного рогатого скота на основе однонуклеотидных полиморфизмов и полногеномного сиквенса

Вирус герпеса крупного рогатого скота 1-го типа (BоAHV1, по современной классификации Varicellovirus bovinealpha1) — один из основных патогенов, поражающих крупный рогатый скот во всем мире и вызывающий как респираторные, так репродуктивные патологии, включая аборты и бесплодие у коров. У вируса выделено три подгруппы (1.1, 1.2а, 1.2b), неодинаково распространенные в мире. Вирус герпеса крупного рогатого скота 5-го типа (BоAHV5, Varicellovirus bovinealpha5), ранее относившийся к BоAHV1, распространен преимущественно в Южной Америке. BоAHV1 и BоAHV5 вызывают заболевания, сходные по клиническим признакам, и остаются предметом пристального внимания. Особенно актуально изучение распространения и частоты выявления этих агентов и их генетических подгрупп. В настоящей работе впервые установлено генетическое разнообразие герпесвирусов, циркулирующих в популяции крупного рогатого скота на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Были дифференцированы 22 штамма и изолята герпесвирусов крупного рогатого скота (BоAHV1 и BоAHV5). Показано наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических типов и подтипов BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b), а также изолятов, принадлежащих к BоAHV5. Целью работы было генотипирование штаммов и изолятов герпесвирусов крупного рогатого скота, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации, при помощи полногеномного сиквенса и поиск однонуклеотидных полиморфизмов для определения генетических подгрупп. Работу проводили в 2022-2025 годах в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, в ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора и в ФГБНУ Федеральный научный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко. Объектами исследования были 21 штамм и изолят BоAHV1, выделенные на территории бывшего СССР и Российской Федерации в период 1969-2004 год, а также вакцинный штамм ТК-А(ВИЭВ)В2, входящий в состав живых вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, длительное время применявшихся в нашей стране для специфической профилактики болезни. Все агенты перед секвенированием прошли три пассажа в культуре клеток MDBK на среде Игла МЕМ с глутамином и добавлением 5 % эмбриональной сыворотки и антибиотиков. Нуклеиновые кислоты экстрагировали с использованием набора лабораторных реагентов для выделения общей ДНК QIAamp DNA Mini Kit (250) («Qiagen», США). Элюцию ДНК с мембраны проводили буфером ТЕ. Концентрацию полученной ДНК измеряли с помощью Qubit 3.0 с применением набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и затем использовали для подготовки библиотек NGS методом лигирования Y-образных адаптеров («Illumina, Inc.», США). Секвенирование осуществляли на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с использованием набора для секвенирования MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles) («Illumina, Inc.», США). Анализ последовательностей фрагментов вируса проводили при помощи пакета MIRA (v.4.9.6), BWA (Burrows-Wheeler Aligner) (v.0.7.15), IGV (v.2.3.78), Samtools (v.1.3.1), GenomeAnalysisTK (v.3.6) (22). Полногеномные последовательности выравнивали при помощи Ugene (v.1.24.1) с использованием алгоритма MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform) (v7.407) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2). Выравнивание последовательностей генов и поиск сайтов для рестриктаз проводили в программе Mega 7 (https://www.megasoftware.net/) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2) в соответствии с информацией о последовательности генов, представленных в GenBank. Построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 7. Филогенетический анализ осуществляли методом ближайших соседей (Neighbor-Joining method), матрицу генетических расстояний рассчитывали методом минимальной эволюции. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов на сайтах рестрикции HPA I, Sac II, Hind III на участках генов UL28, US3 и UL39, а также филогенетический анализ генов US8 и UL27 показали наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических групп BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b). На основе выявленных SNP в секвенированных последовательностях были выделены следующие группы: тип 1.1. — 7 последовательностей BоAHV1, субтип 1.2а — 4 последовательности BоAHV1, субтип 1.2b — 3 последовательности BоAHV1, тип 1.3 — 8 последовательностей BоAHV5, включая штамм ТК-А. Результаты типирования были подтверждены филогенетическим анализом герпесвирусов по генам гликопротеинов Е и B. Поскольку некоторые штаммы, отнесенные к субтипу 1.3, были выделены до массового применения вакцины из штамма ТК-А и вызывали заболевание при экспериментальном введении телятам, можно предположить, что они имеют естественное происхождение или возникли либо в результате мутаций, либо рекомбинаций ТК-А и полевых штаммов BоAHV1. Для подтверждения этого необходимо проведение дальнейших исследований.