Микробиология, вирусология, молекулярная биология. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Вирус герпеса крупного рогатого скота 1-го типа (BоAHV1, по современной классификации Varicellovirus bovinealpha1) — один из основных патогенов, поражающих крупный рогатый скот во всем мире и вызывающий как респираторные, так репродуктивные патологии, включая аборты и бесплодие у коров. У вируса выделено три подгруппы (1.1, 1.2а, 1.2b), неодинаково распространенные в мире. Вирус герпеса крупного рогатого скота 5-го типа (BоAHV5, Varicellovirus bovinealpha5), ранее относившийся к BоAHV1, распространен преимущественно в Южной Америке. BоAHV1 и BоAHV5 вызывают заболевания, сходные по клиническим признакам, и остаются предметом пристального внимания. Особенно актуально изучение распространения и частоты выявления этих агентов и их генетических подгрупп. В настоящей работе впервые установлено генетическое разнообразие герпесвирусов, циркулирующих в популяции крупного рогатого скота на территории бывшего СССР и Российской Федерации. Были дифференцированы 22 штамма и изолята герпесвирусов крупного рогатого скота (BоAHV1 и BоAHV5). Показано наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических типов и подтипов BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b), а также изолятов, принадлежащих к BоAHV5. Целью работы было генотипирование штаммов и изолятов герпесвирусов крупного рогатого скота, выделенных на территории бывшего СССР и Российской Федерации, при помощи полногеномного сиквенса и поиск однонуклеотидных полиморфизмов для определения генетических подгрупп. Работу проводили в 2022-2025 годах в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, в ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора и в ФГБНУ Федеральный научный центр — Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко. Объектами исследования были 21 штамм и изолят BоAHV1, выделенные на территории бывшего СССР и Российской Федерации в период 1969-2004 год, а также вакцинный штамм ТК-А(ВИЭВ)В2, входящий в состав живых вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, длительное время применявшихся в нашей стране для специфической профилактики болезни. Все агенты перед секвенированием прошли три пассажа в культуре клеток MDBK на среде Игла МЕМ с глутамином и добавлением 5 % эмбриональной сыворотки и антибиотиков. Нуклеиновые кислоты экстрагировали с использованием набора лабораторных реагентов для выделения общей ДНК QIAamp DNA Mini Kit (250) («Qiagen», США). Элюцию ДНК с мембраны проводили буфером ТЕ. Концентрацию полученной ДНК измеряли с помощью Qubit 3.0 с применением набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и затем использовали для подготовки библиотек NGS методом лигирования Y-образных адаптеров («Illumina, Inc.», США). Секвенирование осуществляли на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с использованием набора для секвенирования MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles) («Illumina, Inc.», США). Анализ последовательностей фрагментов вируса проводили при помощи пакета MIRA (v.4.9.6), BWA (Burrows-Wheeler Aligner) (v.0.7.15), IGV (v.2.3.78), Samtools (v.1.3.1), GenomeAnalysisTK (v.3.6) (22). Полногеномные последовательности выравнивали при помощи Ugene (v.1.24.1) с использованием алгоритма MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform) (v7.407) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2). Выравнивание последовательностей генов и поиск сайтов для рестриктаз проводили в программе Mega 7 (https://www.megasoftware.net/) по последовательности штамма Cooper (KU198480.2) в соответствии с информацией о последовательности генов, представленных в GenBank. Построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 7. Филогенетический анализ осуществляли методом ближайших соседей (Neighbor-Joining method), матрицу генетических расстояний рассчитывали методом минимальной эволюции. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов на сайтах рестрикции HPA I, Sac II, Hind III на участках генов UL28, US3 и UL39, а также филогенетический анализ генов US8 и UL27 показали наличие в исследованном пуле представителей всех трех известных генетических групп BоAHV1 (1.1, 1.2a и 1.2b). На основе выявленных SNP в секвенированных последовательностях были выделены следующие группы: тип 1.1. — 7 последовательностей BоAHV1, субтип 1.2а — 4 последовательности BоAHV1, субтип 1.2b — 3 последовательности BоAHV1, тип 1.3 — 8 последовательностей BоAHV5, включая штамм ТК-А. Результаты типирования были подтверждены филогенетическим анализом герпесвирусов по генам гликопротеинов Е и B. Поскольку некоторые штаммы, отнесенные к субтипу 1.3, были выделены до массового применения вакцины из штамма ТК-А и вызывали заболевание при экспериментальном введении телятам, можно предположить, что они имеют естественное происхождение или возникли либо в результате мутаций, либо рекомбинаций ТК-А и полевых штаммов BоAHV1. Для подтверждения этого необходимо проведение дальнейших исследований.
Бесплатно
Статья научная
Болезнь Акабане - трансмиссивная арбовирусная инфекция крупного и мелкого рогатого скота, вызываемая вирусом серогруппы Simbu семейства Bunyaviridae. Болезнь наносит большой экономический ущерб, причиняемый животноводческой отрасли в результате эпизоотий, поскольку при заболевании происходят прямые потери от гибели животных, снижения продуктивности домашних жвачных животных и нарушения воспроизводительной функции у больных животных. Болезнь протекает в виде эпизоотии, характеризуется географической приуроченностью, выраженной сезонностью (август-октябрь, февраль) и периодичностью возникновения с интервалом в несколько лет. Для накопления вируса Акабане обычно используют 1-2-суточных белых мышей-сосунов, которые представляют собой наиболее чувствительную систему для изоляции всех буньявирусов. Ранее во Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВиМ) была разработана тест-система для выявления РНК вируса болезни Акабане на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени и подтверждена ее эффективность при обнаружении вируса у экспериментально зараженных мышей и в инфицированных культурах клеток. Однако представляло интерес, с одной стороны, оценить возможности предложенной тест-системы при расширении круга исследуемых объектов, с другой - найти новые модели для изучения и накопления вируса. В настоящей работе мы использовали здоровых морских свинок ( n = 20, масса каждая особи - по 400 г). Эксперимент по заражению морских свинок проводили в трех повторностях. Животных заражали концентрированным культуральным материалом, содержащим вирус болезни Акабане (штамм В8935) с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД 50/см 3. Начиная со 2-х по 6-е сут после заражения, у всех животных ежедневно отбирали пробы крови. В пробах крови от всех морских свинок геном вируса болезни Акабане был обнаружен только на 4-е сут после заражения. Одна особь пала на 1-е сут после заражения (возможно, вследствие неспецифической реакции, так как выявить геном вируса болезни Акабане при исследовании образцов органов, взятых post mortem у этого животного, не удалось). Дополнительно для получения биоматериала на 4-е сут после заражения у нескольких морских свинок были отобраны органы (мозг, легкое, почки, лимфоузел, сердце), в тканях которых также обнаружили вирус Акабане. Этим подтверждается эффективность разработанной тест-системы при диагностике вируса болезни Акабане и возможность использовать для его накопления еще один модельный объект - морских свинок.
Бесплатно
Статья научная
Исследование микробиоты желудочно-кишечного тракта домашних животных играет важную роль в поиске способов поддержания их здоровья. Особый интерес представляют собаки (Canis familiaris), которые используются не только как домашние животные, но и в правоохранительных органах, сельском хозяйстве и т.д. Одна из перспективных стратегий лечения и профилактики заболеваний, связанных с пищеварительной системой домашних животных, — применение пробиотиков. Современные подходы в анализе больших микробных сообществ с использованием секвенирования ДНК открывают новые возможности для исследования микробиоты собак и выделения из ее образцов штаммов-кандидатов для использования в качестве пробиотиков. В настоящей работе впервые методом высокопроизводительного метагеномного секвенирования охарактеризована фекальная микробиота клинически здоровой немецкой овчарки на всех таксономических уровнях (от типа до вида) и на ее основе целенаправленно отобраны виды-кандидаы в пробиотики. Выявлено, что Enterococcus lactis не детектируется стандартным метагеномным анализом из-за высокой гомологии с E. faecium, что подтверждено выделением трех штаммов E. lactis при отсутствии соответствующих прочтений в метагеноме. Целью исследования был метагеномный анализ фекальной микробиоты собак для поиска штаммов-кандидатов в пробиотики. Работу проводили на базе ФГБОУ ВО Российский биотехнологический университет (РОСБИОТЕХ) (г. Москва) в 2024-2025 годах. Для метагеномного анализа были отобраны пробы фекалий от клинически здоровой немецкой овчарки возрастом 4 года. Выделение тотальной ДНК проводили с использованием набора ZymoBIOMICS DNA Kit («Zymo Research», США). Для подготовки библиотек использовали 100 нг ДНК и набор Illumina DNA Prep (M) Tagmentation («Illumina, Inc.», США). Секвенирование выполняли на платформе NovaSeq 6000 («Illumina, Inc.», США). Таксономическую классификацию осуществляли алгоритмом LCA в MEGAN6 Ultimate Edition (v6.18.7) при пороге относительной абундантности > 0,01 %. В результате секвенирования было получено 24,009 млн чтений (2,407 Гб данных), из которых 61,97 % успешно классифицированы на таксономическом уровне и 12,6 — на функциональном (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG). Доминирующим доменом оказались бактерии — 99,91 %. Для выделения изолятов микроорганизмов образцы фекалий ресуспендировали в 10 мл 0,9 % NaCl, после чего делали серийные стандартные разведения, высевая каждое разведение на чашки Петри со средой MRS («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия). Всего было выделено 100 штаммов бактерий, 17 из которых были идентифицированы методом секвенирования гена 16S рРНК. Для некоторых штаммов использовали амплификацию с видоспецифическими праймерами. Метагеномный анализ выявил доминирование бактерий типа Firmicutes (77,28 %) и Actinobacteria (18,88 %). На уровне класса наиболее распространенными были Clostridia, Coriobacteriia и Bacilli; отряда — Eubacteriales, Coriobacteriales и Lacto-bacillales. Видовой состав характеризовался доминированием Ruminococcus gnavus (9,45 %) и Collinsella intestinalis (8,13 %), что может отражать адаптацию микробиоты к составу рациона животного. Анализ выявил 8 видов-кандидатов в пробиотики, присутствовавших в значимых количествах (> 0,05 %): Enterococcus faecium, Bifidobacterium pseudolongum, Latilactobacillus curvatus, Lactiplantibacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii, Limosilactobacillus reuteri, Latilactobacillus sakei и Leuconostoc mesenteroides. Из 100 выделенных изолятов 17 были идентифицированы до вида: Enterococcus faecium (7 штаммов), Lactiplantibacillus plantarum (6 штаммов), Enterococcus lactis (3 штамма) и Latilactobacillus sakei subsp. sakei (1 штамм). Наличие E. lactis среди выделенных бактерий при его отсутствии в данных метагенома, вероятно, обусловлено генетической схожестью этого микроорганизма с видом E. faecium. Исследование подтверждает потенциал использования метагеномного профилирования для целенаправленного поиска пробиотических штаммов. Не все потенциально перспективные виды (B. pseudolongum, L. curvatus, L. johnsonii, L. reuteri, L. mesenteroides) удалось выделить из образцов, что указывает на необходимость дальнейших работ по их изоляции и изучению пробиотических свойств уже полученных штаммов. Кроме того, полученные результаты представляют интерес с точки зрения состава здоровой микробиоты пищеварительной системы собак.
Бесплатно
Статья научная
Современное российское промышленное птицеводство имеет тесные торговые отношения со многими странами. В настоящее время гепатит Е зарегистрирован у кур в Австралии, США, Испании, Венгрии и др., представляя серьезную угрозу птицеводческим хозяйствам. Вирус вызывает у кур поражения печени, органов иммунной системы - селезенки и тимуса, глубокие нарушения гомеостаза (в частности, гематологических показателей). Первое сообщение о генетической идентификации ВГЕ у кур в Российской Федерации было сделано в 2009 году, однако эпизоотическая обстановка по вирусному гепатиту Е у кур оставалась малоизученной. В работе представлены результаты изучения 415 образцов печени от кур-несушек и бройлеров разного возраста в 68 птицеводческих хозяйствах из 36 регионов РФ и в 4 хозяйствах из Республики Беларусь, Казахстана и Украины на наличие вируса гепатита Е (ВГЕ) методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). За период с 2009 по 2012 год от кур нами было получено 14 изолятов ВГЕ, обозначенных как российские (13 - в хозяйствах РФ, один - в Казахстане), и показана их высокая генетическая вариабельность. Вирус выделяли не только у птицы с признаками поражения печени, но также у клинически здоровых особей. Ассоциированные агенты, вызывающие сходные признаки (такие, как вирус лейкоза, вирус болезни Марека или аденовирус), нами выявлены не были. На территории РФ изоляты выявлены в хозяйствах Амурской, Вологодской, Ивановской, Калужской, Московской, Самарской, Саратовской областей, а также в Республике Марий Эл. Среди обследованной птицы чаще всего вирус детектировали у кур кросса Ross 308 (восемь изолятов из 14). При анализе нуклеотидной последовательности гена капсидного белка (ORF2) у 14 российских изолятов ВГЕ установлено, что к европейскому генотипу 3 можно отнести российские изоляты aHEV18198, aHEV19555, aHEV16211, aHEV18479 и aHEV18481. Из них aHEV16211, aHEV18479, aHEV18481 оказались генетически близки к вирусам из Китая (China-09-G57 и др.), США (NY449, CA697A) и Европы (06-4582 и др.). Изоляты aHEV18198 и aHEV19555 были родственны с изолятами из Австралии и США (Guelph01, CA518.3). Кроме того, семь изолятов формируют отдельную генетическую группу, к которой примыкает линия из еще двух изолятов (aHEV18381 и aHEV18505). Таким образом, на территории РФ циркулируют ВГЕ европейского генотипа 3 и изоляты из российской группы, которая пока не отнесена ни к одному из упоминавшихся ранее генотипов.
Бесплатно
Статья научная
Кишечник птиц представляет собой не только первую линию защиты от экзогенных патогенов, но и самый большой орган, участвующий в обеспечении иммунитета. Микрофлора, обитающая в слепых отростках кишечника, выполняет многочисленные функции по поддержанию гомеостаза макроорганизма, в том числе играя важную роль в процессах переваривания кормов. Препараты пробиотиков, антибиотиков, пребиотиков, симбиотиков, ферментов и т.п. способны прямо или косвенно влиять на микрофлору кишечника птицы и, следовательно, увеличивают суточный прирост живой массы цыплят, сохранность, убойный выход, улучшают переваримость питательных веществ корма, качество и санитарную безопасность тушек. Однако влияние этих препаратов на микрофлору кишечника цыплят до конца не изучено. Появление и развитие современных молекулярно-генетических методов позволило изучать разнообразие микроорганизмов без ограничений, сопутствующих традиционным техникам. Мы изучили состав и возрастную динамику микрофлоры в желудочно-кишечном тракте у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 методами T-RFLP с RT-PCR при использовании добавок к полнорационному комбикорму, которыми служили пробиотик целлобактерин-Т и антибиотик стафак-110. Проведенный анализ показал, что введение в рацион птицы антибиотика и пробиотика способствовало увеличению общего числа бактерий, причем численность представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (целлюлозолитические бактерии, лактобактерии, бифидобактерии, бациллы, селеномонады) возрастала, а доля нежелательных энтеробактерий, актиномицетов снижалась. У бройлеров из группы, получавшей пробиотик, по сравнению с птицей, в рацион которой добавляли антибиотик, в исследуемых отделах кишечника было больше целлюлозолитических бактерий, в слепых отростках - в 10-100 раз больше лактобактерий, бифидобактерий, бацилл, а также меньше клостридий и транзитных бактерий. Многочисленные исследования пробиотических препаратов уже подтвердили их эффективность в птицеводстве, что отражено в зоотехнических показателях, однако только с использованием современных молекулярных методов идентификации микрофлоры желудочно-кишечного тракта (в частности, T-RFLP-анализ с RT-PCR) можно определить, на представителей каких таксономических групп микроорганизмов влияет тот или иной препарат, для дополнительного обоснования рациональности его использования.
Бесплатно
Статья научная
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukemia virus, BLV) распространен во всем мире и представляет серьезную угрозу для животноводства многих стран, не исключая Российскую Федерацию. На основании филогенетических исследований, проведtнных с помощью кластерного анализа гена env, в настоящее время классифицировано двенадцать генетических групп вируса лейкоза. В настоящей работе впервые на основе филогенетического анализа подтвержден энзоотический статус BLV на территории России и установлена циркуляция двух основных генетических типов — G4 и G7. Выявлена четкая корреляция между эпизоотической ситуацией и циркулирующим генотипом. Целью работы было проведение филогенетического анализа вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV), циркулирующего на территории Российской Федерации, для установления его происхождения, эволюционных траекторий и оценки эпизоотических последствий, включая выявление взаимосвязи между двумя генетическими типами (G4 и G7) и эпизоотической ситуацией в различных регионах страны. Работа была выполнена в Уральском НИВИ — структурном подразделении ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН в период с 2023 по 2025 годы. Клинические исследования проводили в сельскохозяйственных организациях Свердловской, Тюменской областей, Краснодарского края. Объектом исследования служил крупный рогатый скот разных половозрастных групп местного разведения. Серологические исследования проводили методом ИФА, с использованием набора ID Screen® BLV Competition (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Россия). Учет результатов твердофазного ИФА осуществляли на фотометре iMark TM («Bio-Rad Laboratories», США). ДНК выделяли из цельной крови при помощи коммерческого набора АмплиПрайм РИБО-преп ВЕТ (ООО «НекстБио», Россия). Полимеразную цепную реакцию проводили в режиме реального времени, с применением амплификатора CFX96 Touch («Bio-Rad Laboratories», США). Для амплификации фрагмента гена env 970 п.н. использовали модернизированный метод полугнездовой ПЦР. Реакцию проводили с использованием БиоМастер HS-Taq ПЦР (2х) (ООО «Биолабмикс», Новосибирск). Далее ампликоны направляли в ЗАО «ЕВРОГЕН», где проводили ДНК-секвенирование на генетическом анализаторе 3500 Applied Biosystems («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). Секвенирование проводили в двух направлениях с использованием прямого AP_4762 3′-GCTCTCCTGGCTACTGACC-5′ и обратного ZM5_5733 3′-GCTAGGCCTAAGGTCAGGGCCGC-5′ праймеров. Филогенетический анализ осуществляли с использованием пакета программ FinchTV, SeqScape 3.0, Web сервиса Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), MegaX 10.0.5. Первичное выравнивание проводили на референсную полногеномную последовательность BLV (NCBI Reference Sequence: NC_001414.1, Pet-ropoulos, C.J.), затем осуществляли ручное редактирование последовательностей. В исследование включали образец FLK BLV, полученный из вирус-продуцирующей клеточной линии, подготовленной и криоконсервированной в лаборатории заранее. Полученные после секвенирования по Сэнгеру удачные последовательности (n = 57) выравнивали совместно с изолятами из NCBI GenBank, имеющими разное географическое происхождение, ранее классифицированными и принадлежащими к генотипам от G1 до G12. Установлено, что на территории РФ циркулируют два основных генетических типа вируса лейкоза крупного рогатого скота — G4 и G7, при этом G4 доминирует в регионах с напряженной эпизоотической ситуацией по лейкозу (Краснодарский край), тогда как G7 определен на территории субъектов с низкой инфицированностью лейкозом (Свердловская, Тюменская области). Выявлена чёткая корреляция между эпизоотическим статусом и циркулирующим генотипом. Все 12 генотипов (G1-G12) образовали монофилетические кластеры с высокими bootstrap (> 85 %). Филогенетически G4 формировал крупную кладу с изолятами из Европы, Азии, Африки и Америки. Тюменские изоляты G4 образовали ультра-компактную группу с короткими ветвями, что указывает на относительно недавний занос, вероятно, связанный с импортом скота из ЕС в 2000-е годы. Краснодарские и башкирские изоляты G4 были интегрированы в тот же кластер, что свидетельствует об их активном распространении. Генотип G7, напротив, занимал базальное положение в глобальной филогении, имел более древнюю эволюционную траекторию и, возможно, был связан с завозами из Восточной Европы после Второй мировой войны. Редкие генотипы G8 (Московская обл.) и G12 (Казахстан) имели ограниченное распространение. Генотип G12 филогенетически ближе к G7 (генетическая дистанция 2,7 %). Таким образом, анализ эпизоотических, молекулярно-генетических данных указывает на относительно недавнее проникновение G4 в Россию с последующей быстрой адаптацией. Полученные данные обосновывают необходимость регулярного молекулярно-эпизоотологического мониторинга для оценки связи «генотип—фенотип», прогнозирования рисков для восприимчивых животных и совершенствования диагностических и противоэпизоотических мероприятий.
Бесплатно
