Генотипирование инбредных линий и гибридов подсолнечника селекции Армавирской опытной станции ВНИИМК с помощью микросателлитных локусов

Identification of lines and hybrids is an actual task of the modern breeding. The purpose of the present work was to develop an optimal system of microsatellite DNA-markers for genotyping of sunflower inbred lines and hybrids bred at the Armavirskaay experi- mental station – a branch of V.S. Pustovoit AllRussian Research Institute of Oil Crops (AOS VNIIMK). As an object of the research we used 13 lines (VA 93, VA 760, VA 761, VA 4, VA 6, VA 384, VA 389, VA 317, VA 325, VK 21, VA 337, VA 737, and VA 812) and 10 hybrids (Bars, Natali, Iren, Melin, Medas, Aris, Arneb, Berkut, Arlin, Arimi) from sunflower collection of AOS VNIIMK. We used 18 pair of primers which showed presence of polymorphism to genotype sunflower inbred lines and hybrids. The most polymorphic loci were Har 514, ORS 610 and Har 1608 (na equal 3–4, PIC – from 0.51 to 0.65, ne – from 2.04 to 2.85). Loci Har 1327 and ORS 1079 showed low polymorphism (na equal 2, PIC – from 0.14 to 0.25, ne – from 1.16 to 1.33). The rest loci had a middle level of polymorphism (na equal 2–3, PIC – from 0.36 to 0.50, ne – from 1.56 to 2.00). The average number of alleles per a locus was 2.3. Accounted values characterize polymorphism of studied samples as average. Analysis of electrophoretic spectra of 18 polymorphic SSR-loci proved uniqueness of each line alleles, except lines which are analogs of each other. Uniqueness of the studied lines was 82%. The most loci inherited amplicons by codominant type but there were also some dominant ones: ORS 366, ORS 307, ORS 610, Har 1442, Har 432. All studied hybrids had discrepant genotypes. Uniqueness of the hybrid collection is 100%. Used SSR-loci can be considered as optimal ones for genotyping of sunflower inbreds and hybrids developed at AOS VNIIMK.

Введение. Использование молекулярных маркеров дает особые преимущества при оценке генетического разнообразия, для идентификации и определения генетической чистоты сортов, а также для изучения полиморфизма и генетического сходства у основных сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза [1], соя [2; 3], рис [4], картофель [5], люцерна [6], сорго [7] и т.д. Уровень полиморфизма и генетических отношений изучали с помощью различных молекулярных маркеров, таких как RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) и SSR (Single Sequence Repeats). Из-за своей мультиаллельной и высокополиморфной природы микроса-теллитные маркеры, или SSR, в настоя- щее время являются предпочтительным методом молекулярной селекции у растений. У подсолнечника (Helianthus annuus L.) микросателлиты были особенно информативны при изучении филогенетических взаимоотношений, паспортизации сортов и генетических взаимоотношений между инбредными линиями [8; 9; 10]. Идентификация линий и гибридов – актуальная задача современной селекции. Для идентификации и паспортизации линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК ранее были выполнены оптимизация условий ПЦР, подбор микроса-теллитных локусов для создания системы молекулярных маркеров. Некоторые из изученных линий обладали идентичным составом аллелей микросателлитных локусов. Это предполагало дальнейший скрининг SSR-локусов для более точной идентификации генотипов подсолнечника [11]. Цель данной работы – разработка оптимальной системы микросателлитных ДНК-маркеров для генотипирования ин-бредных линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили 13 линий (ВА 93, ВА 4, ВА 6, ВА 760 [12], ВА 761, ВА 317, ВА 325, ВК 21 ими [13], ВА 337 [14], ВА 384 [15], ВА 389 [16], ВА 737, ВА 812) и 10 гибридов (Барс, Беркут, Арими [17], Медас, Мэлин, Натали [18], Ирэн [19], Арнеб [20], Арис [21], Арлин) коллекции подсолнечника Армавирской опытной станции ВНИИМК. Геномную ДНК выделяли из семядольных листьев 5–7-дневных этиолированных проростков подсолнечника с помощью модифицированного метода Saghai-Maroof et аl. [22] с использованием СТАВ-буфера. Для проведения ПЦР использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3 мM MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК. Амплификацию проводили в приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). Условия амплификации: начальная денатурация при 96 °С в течение 2 мин; затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 55–60 °С в течение 40 с, элонгация – 1 мин при 70 °С, денатурация при 94 °С – 30 с, финальная элонгация – 2 мин. В этом исследовании мы использовали 18 праймеров SSR, разработанных N. Paniego et al. и S. Tang et al. [9; 23]. Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1 х SB-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE. 2, ДНК-технология, Россия) в течение 1– 1,5 ч при силе тока 60 mA и напряжении 90–100 V. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализацию и документирование результатов электрофореза обеспечивали при помощи трансиллюминатора ECX-F20.M (WILBER LOURMAT, Франция) и фотоаппарата Canon EOS 550D (Япония). Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили визуально, путём сравнения со стандартным образцом – маркером молекулярной массы 100 bp (Сибэнзим, Москва). Для определения различий между линиями подсолнечника данные ПЦР-анализа были обработаны кластерным анализом, методом Ward с помощью пакета программ (Statistica 6.0). Генетические дистанции рассчитаны с помощью Евклидова расстояния.

Индекс полиморфного содержания (PIC) [24] и эффективное число аллелей (ne) [25] вычисляли по формулам:

PICi= 1-∑ Рij2, где Р – частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов.

ne=1/ ∑ Рij2, где ne – эффективное число аллелей.

Результаты и обсуждение. Восемнадцать пар праймеров, показавших наличие полиморфизма, были использованы для генотипирования инбредных линий и гибридов подсолнечника селекции Армавирской опытной станции ВНИИМК. Для них была выполнена оптимизация условий ПЦР, при которых продукты амплификации четко визуализировались. Характеристика амплифицированных локусов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика ДНК-локусов, использованных для генотипирования линий подсолнечника АОС ВНИИМК

Армавирская ОС ВНИИМК, 2019 г.

Локус	Молекулярный вес продукта (п.н.)	PIC	n a	n e
Har 1796	180; 280	0,36	2	1,56
ORS 366	220; 250	0,47	2	1,88
ORS 811	150; 200	0,36	2	1,56
ORS 1287	200; 210	0,47	2	1,88
ORS 307	160; 190	0,36	2	1,56
ORS 1079	450; 480	0,25	2	1,33
ORS 561	410; 500	0,50	2	2,00
ORS 533	170; 175	0,50	2	2,00
Har 1327	195, 205	0,14	2	1,16
Har 1442	0; 165	0,47	2	1,88
ORS5	320; 350	0,42	2	1,72
ORS 559	100; 150	0,50	2	2,00
ORS 815	180; 200	0,47	2	1,88
ORS 1144	136; 177	0,42	2	1,72
ORS 610	170; 180; 190	0,51	3	2,04
Har 432	170; 175; 180	0,37	3	1,64
Har 514	180; 185; 190	0,64	3	2,85
Har 1608	240; 260; 270, 280	0,65	4	2,85

Примечание: PIC – индекс полиморфного содержания; n a – наблюдаемое число аллелей; n e – эффективное число аллелей.

У 14 SSR локусов обнаружено по два аллеля, по три аллеля – у локусов Har 517, ORS 610 и Har 432. У локуса Har 1608 было выявлено четыре аллеля.

Для определения дискриминационного потенциала системы маркеров в пределах использованной группы линий вычисляли такие показатели, как наблюдаемое число аллелей на полиморфный локус (na), ин- декс полиморфного содержания (PIC) и эффективное число аллелей (ne) (табл. 1).

Наиболее полиморфными локусами были Har 514, ORS 610 и Har 1608 (n a равное 3–4, PIC – от 0,51 до 0,65 и n e – от 2,04 до 2,85). Локусы Har 1327 и ORS 1079 имели низкие показатели полиморфизма (n a равное 2, PIC – от 0,14 до 0,25 и n e – от 1,16 до 1,33). Остальные локусы имели средний уровень полиморфизма (n a равное 2–3, PIC – от 0,36 до 0,50, n e – от 1,56 до 2,00) (табл. 1).

Среднее число аллелей на локус составило 2,3, что совпадает с полученным ранее для 12 линий подсолнечника Армавирской опытной станции ВНИИМК [11]. Рассчитанные нами величины характеризуют полиморфизм исследованных образцов коллекции как средний. Анализ электрофоретических спектров 18 полиморфных микросателлитных локусов линий показал индивидуальность аллельного состава каждой из них (табл. 2).

Линии ВА 760 с ВА 761 и ВА 325 с ВК 21, которые являются аналогами по отношению друг к другу, имели идентичные генотипы по 18 локусам. Их идентичность была показана в работе [11] при использовании 11 микросателлитных и 4 изоферментных локусов. Увеличение количества маркерных локусов не выявило различий между данными линиями. Но были идентифицированы линии ВА 93 и ВА 760, не показавшие отличий ранее [11] (табл. 2). Уникальность проанализированной группы линий составила 82 %.

Для определения степени сходства между линиями на основе матрицы состояний бинарных признаков был проведен кластерный анализ методом Ward и построена дендрограмма генетических взаимоотношений между изученными линиями (рис. 1).

Рисунок 1 – Дендрограмма генетического сходства 13 линий селекции Армавирской ОС ВНИИМК на основе 18 полиморфных SSR-локусов ДНК

Анализ дендрограммы показал, что изученные линии разделились на два кластера, с генетической дистанцией между ними 9,3. В один кластер попали материнские линии ВА 93, ВА 760, ВА 761, ВА 4, ВА 6, а также две отцовские линии ВА 384 и ВА 389. Второй кластер объединил отцовские линии ВА 317, ВА 337, ВА 737, ВА 812, ВА 325, ВК 21. Как было отмечено в работе Гучетль С.З. с соавторами [11], объединение линий в кластеры в большей степени зависело от принадлежности к отцовской или материнской линии.

Наследование микросателлитных локусов обычно носит кодоминантный характер. Это в значительной мере обуславливает их использование для паспортизации гибридов, поскольку позволяет определить наличие обоих родительских аллелей в их генотипах. В нашем исследовании у гибридов некоторые из изучаемых локусов проявили себя как доминантные: ORS 366, ORS 307, ORS 610, Har 1442, Har 432. У этих гибридов маркерный локус был представлен лишь одним из родительских аллелей. Четыре локуса не выявили полиморфизма: ORS 307, ORS 610, Har 1442 и Har 1327. Результаты генотипирования гибридов представлены в таблице 3.

Таблицы 2 и 3

У большинства локусов наследование ампликонов происходило по кодоминантному типу. У локусов, находящихся в гетерозиготном состоянии, мы наблюдали оба родительских ампликона (гибрид Арис), в гомозиготном состоянии – один ампликон (гибрид Натали) (рис. 2).

Рисунок 2 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у гибридов подсолнечника Натали, Арис и их родительских линий по локусу ORS 811.

ОК – отрицательный контроль.

М – маркер молекулярного веса 100 пн

Несмотря на наличие мономорфных локусов, все изученные гибриды имели отличающиеся генотипы. Уникальность коллекции гибридов 100 %.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что система маркеров из 18 пар микросателлитных локусов выявляет полиморфизм фракций ам-плифицированной ДНК. Дискриминационный потенциал системы маркеров в пределах использованной группы линий характеризуется как средний. Уникальность проанализированной коллекции линий Армавирской опытной станции ВНИИМК составила 82  %, гибридов –  100  %.

Использованные микросателлитные локусы являются оптимальными для генотипирования инбредных линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК.