Генотипирование коров по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации

Насыщение рынка продовольствия качественными продуктами отечественного производства в достаточном объёме невозможно без интенсификации животноводства , где одной из составляющих является эффективная селекция . Сегодня уже ни у кого не вызывает сомнения эффективность использования генетических маркёров , таких как группы крови , биохимические белки , ферменты , а также новых маркёров , выявляемых с помощью ПЦР - анализа ( полимеразная цепная реакция ). Применение такой маркёрной технологии в селекции позволяет выявлять генетические дефекты и прогнозировать генетический потенциал продуктивности животных сразу после рождения ( Г . М . Гончаренко , 2009).

В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться гены молочных белков, а именно каппа-казеина и бета-лактоглобулина. Ген каппа-казеина – связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель В гена каппа-казеина ассоциирована с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока. Аллель В гена бета-лактоглобулина связана с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, тогда как аллель А характеризуется с высоким содержанием сывороточных белков (N. Strzalkowska et al., 2002; Я.А. Хабибрахманова, 2009).

Широкий обмен генетическим материалом между странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний , а также заболеваний , вызываемых редкими мутациями , возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород . В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций . Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строго генетического контроля импортируемого генетического материала , а также изучение возможных механизмов распространения мутаций ( А . Е . Маріуца , 2005).

Одним из таких наследственных заболеваний крупного рогатого скота является BLAD - мутация , характеризующаяся дефицитом лейкоцитарной адгезии ( Г . М . Гончаренко , 2009).

В связи с этим , мы изучили у коров частоты генов каппа - казеина и бета - лактоглобулина , определяющих белковый состав молока и BLAD - мутации , связанной с резистентностью к заболеваниям .

Материалы и методы . Исследования проводились в ООО им . Тукая Балтасинского района Республики Татарстан . Для определения полиморфизма генов каппа - казеина и бета - лактоглобулина , а также BLAD - мутации было отобрано 107 черно - пёстрых голштинских коров .

Кровь , получали из яремной вены животных , вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ .

Выделение ДНК из крови проводили разработанным и оптимизированным нами аммиачным способом .

Генотипирование коров по гену каппа - казеина проводили разработанными и оптимизированными нами способами : 1. высокоточной ПЦР и 2. аллель - специфичной ПЦР .

• 1.    ПЦР проводили на программируемом термоциклере « Терцик » ( Россия ) в объеме 20 мкл , содержащей 60 м M Трис -HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол ; 0,1 мМ тритон Х -100; 0,2 мМ дНТФ , 0.5 ед . Taq ДНК полимеразы ; по 0,5 мкМ праймеров JK5-hs ( состоит из 5^/- некомплементарного участка ( n ) длиной 5 нуклеотидов и 3^/- комплементарного участка ( N ) длиной 25 нуклеотидов ( расчетная nN T m =70⁰C; N T m =60,8⁰C) и JK3-hs ( состоит из 5^/- некомплементарного участка ( n ) длиной 4 нуклеотида и 3^/- комплементарного участка ( N ) длиной 26 нуклеотидов ( расчетная nN T_m =73,5⁰C; N T_m =66,7⁰C),

  сконструированных Р . Р . Вафиным и др . (2007); 1 мкл пробы ДНК , в следующих режимах :

• 2.    ПЦР проводили на программируемом термоциклере « Терцик » ( Россия ) в объеме 20 мкл , содержащей 60 м M Трис -HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол ; 0,1 мМ тритон Х -100; 0,2 мМ дНТФ ; 0,5 ед . Taq ДНК полимеразы , 2 пары аллель - специфичных праймеров по 0,5 мкМ каждого : 1- ая пара B - аллель - специфичных праймеров «B-F-hs» и «B-R-hs» и 2- ая пара A - аллель - специфичных праймеров «A-F-hs» и «A-R-hs», сконструированных Р . Р . Вафиным и др . (2008); 1 мкл пробы ДНК , в следующем оптимальном режиме амплификации : ×1: 94⁰ С – 4 мин ; ×40: 94⁰ С – 1 мин , 72⁰ С – 1 мин ; ×1: 72⁰ С – 10 мин .

×1: 94⁰ С – 4 мин ; ×40: 94⁰ С – 30 сек , 72⁰ С – 30 сек ; ×1: 72⁰ С – 10 мин ,

×1: 94⁰ С – 4 мин ; ×40: 94⁰ С – 10 сек , 68⁰ С – 20 сек ; ×1: 72⁰ С – 5 мин , ×1: 94⁰ С – 4 мин ; ×40: 94⁰ С – 10 сек , 72⁰ С – 20 сек ; ×1: 72⁰ С – 5 мин . Для определения аллельного полиморфизма гена каппа - казеина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед . эндонуклеазы рестрикции HinfI в 1× буфере « О » или 10 ед . эндонуклеазы рестрикции HindIII в × буфере «W» фирмы СибЭнзим ( Россия ) при 37⁰C в течение ночи .

Генотипирование коров по гену бета - лактоглобулина проводили оптимизированным нами способом .

ПЦР проводили на программируемом термоциклере « Терцик » ( Россия ) в объеме 20 мкл , содержащей буфер (60 мМ трис -HCl ( рН 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол ; 0,1 мМ тритон Х -100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы , 0,5 мкМ праймера BLGP3, 0,5 мкМ праймера BLGP4, сконструированных Дж . Ф . Медрано , Е . Акилар - Кордова (J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova, 1990), 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме : ×1:94⁰ С – 4 мин ; ×38:94⁰ С – 10 сек , 60⁰ С – 10 сек , 72⁰ С – 10 сек ; ×1:72⁰ С – 5 мин ; хранение : 4⁰ С .

Для определения полиморфизма гена бета - лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед . эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1× буфере « С » фирмы СибЭнзим ( Россия ) при 37⁰ С течение ночи .

Выявление животных - носителей BLAD - мутации осуществляли оптимизированным нами способом .

ПЦР проводили на программируемом термоциклере « Терцик » ( Россия ) в объеме 20 мкл , содержащей буфер (60 мМ трис -HCl ( рН 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол ; 0,1 мМ тритон Х -100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы , по 0,5 мкМ праймеров BLAD-F и BLAD-R, сконструированных К . Е . Грир и др . (C.E. Greer et al., 1991), 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме : ×1:94⁰ С – 4 мин ; ×40:94⁰ С – 20 сек , 69⁰ С – 20 сек , 72⁰ С – 20 сек ; ×1:72⁰ С – 7 мин ; хранение : 4⁰ С .

Для выявления BLAD - мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед . эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1× буфере « С » фирмы СибЭнзим ( Россия ) при 37 ⁰ С течение ночи .

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% ( каппа - казеин и бета - лактоглобулин ) и 4% ( BLAD - мутация ) агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг / мл ) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В / см в течение 40 мин в 1× ТВЕ буфере .

После электрофореза гель просматривали в УФ - трансиллюминаторе при длине волны 310 нм . Идентификацию генотипов каппа - казеина , бета - лактоглобулина и BLAD - мутации определяли по количественным и качественным признакам .

Частоту встречаемости генотипов каппа - казеина и бета - лактоглобулина определяли по формуле : р = n / N , где р – частота определения генотипа , n – количество особей , имеющих определенный генотип , N – число особей .

Частоту отдельных аллелей определяли по формулам :

Р А = (2nAA+nAB) : 2N и q B = (2nBB+nAB) : 2N , где P А – частота аллеля А , q_B – частота аллеля В , N – общее число аллелей .

По закону Харди - Вайнберга ( В . Л . Петухов , А . И . Жигачёв , Г . А . Назарова , 1985) рассчитывали ожидаемые частоты генотипов в исследуемой популяции .

Результаты исследований . При проведении высокоточной ПЦР в режиме разработанного нами способа для амплификации фрагмента гена каппа - казеина крупного рогатого скота с модифицированными праймерами JK5-hs: 5^/-gggggATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3^/ и JK3-hs: 5^/-ccccGCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3^/ амплифицировались только специфичные ПЦР продукты размером 363 bp.

На основании положительного результата по исключению неспецифичной амплификации нами были предприняты дальнейшие действия по оптимизации режима 2- х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68 (72)⁰ С .

В режиме 2- х стадийной ПЦР модифицированные праймеры JK5-hs и JK3-hs эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа - казеина крупного рогатого скота длиной 359 bp, а ПДФР - HinfI профиль ( AA =139/131/89 bp, BB =270/89 bp и AB =270/139/131/89 bp) и ПДФР - HindIII профиль ( AA =359 bp, BB =222/137 bp и AB =359/222/137 bp) идентифицируют его генотипы .

При проведения аллель - специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа - казеина используются две пары аллель - специфичных праймеров , не имеющие дополнительных некомплементарных ни к одному из аллелей гена каппа - казеина крупного рогатого скота «mismatch- нуклеотидов » в позиции –2 от

3^/- терминальных нуклеотидов праймеров , но имеющие 5^/- некомплементарные участки (n) длиной 5-3 нуклеотидов : В - аллель - специфичные праймеры «B-F-hs»: 5^/-cccccGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3^/ и «B-R-hs»: 5^/-cCcccGATGTCTCCT TAGAGTATTTAGACC-3^/, которые инициируют амплификацию В - аллель - специфичного фрагмента ДНК гена каппа - казеина крупного рогатого скота размером 156 bp; А - аллель - специфичные праймеры A-F-hs: 5^/-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3^/ и A-R-hs: 5^/-gggGGGTGCCT AACCTTATACAGCCTTTCG-3^/, которые инициируют амплификацию А - аллель - специфичного фрагмента ДНК гена каппа - казеина крупного рогатого скота размером 242 bp; проводили 2- х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72⁰ С .

При проведении ПЦР - анализа в ООО им . Тукая черно - пестро х голштинских коров по локусу гена каппа - казеина нами получены следующие результаты , что из 107 коров 68 (63,6%) имели генотип АА ; 36 (33,6%) – АВ и лишь 3 (2,8%) – ВВ . При этом частота аллеля А составила 0,80, а аллеля В – 0,20 ( табл . 1).

1. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена каппа - казеина у коров

Хозяйство		n	Частота генотипов						Частота аллелей		χ 2
			АА		АВ		ВВ
			n	%	n	%	n	%	А	В
ООО им . Тукая	Н	107	68	63,6	36	33,6	3	2,8	0,80	0,20	0,38
	О		69	64,0	34	32,0	4	4,0

Н – наблюдаемое распределение генотипов , О – ожидаемое распределение генотипов .

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета - лактоглобулина нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров : BLGP3: 5'-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3', праймера BLGP4: 5'-CAGGACAC CGGCTCCCGGTATATGA - 3' по оптимизированной нами технике ПЦР - ПДРФ .

Праймеры BLGP3+BLGP4 инициируют амплификацию фрагмента гена бета - лактоглобулина крупного рогатого скота длиной 262 bp, а β -LGB- ПДРФ - HaeIII профиль (AA=153/109 bp, BB=109/79/74 bp и AB=153/109/79/74) идентифицирует его генотипы .

При исследовании в ООО им. Тукая черно-пестро х голштинских коров по локусу гена бета-лактоглобулина методом ДНК-анализа получены следующие результаты, что из 107 коров 14 имели генотип АА, 60 коров – генотип АВ, 33 коровы – генотип ВВ. Частота гомозиготного генотипа АА составила 13,1%, гетерозиготного генотипа АВ – 56,1%, гомозиготного генотипа ВВ –30,8%, при этом частота аллеля А составила 0,41 и аллеля В – 0,59 соответственно (табл. 2).

2. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена бета - лактоглобулина у коров

Хозяйство		n	Частота генотипов						Частота аллелей		χ 2
			АА		АВ		ВВ
			n	%	n	%	n	%	А	В
ООО им . Тукая	Н	107	14	13,1	60	56,1	33	30,8	0,41	0,59	2,55
	О		18	16,8	52	48,4	37	34,8

Н – наблюдаемое распределение генотипов , О – ожидаемое распределение генотипов .

Для оценки качества работы известных протоколов по выявлению у крупного рогатого скота BLAD - мутации нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров : BLAD-F: 5^/-TCCGGAGGGCCAAGGGCTA-3^/ и BLAD-R: 5^/-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG-3^/ по оптимизиро - ванной нами технике ПЦР - ПДРФ .

Праймеры BLAD-F+BLAD-R инициируют амплификацию фрагмента для выявления BLAD - мутации крупного рогатого скота длиной 58 bp, у здоровых животных ПДРФ - HaeIII профиль 49/9 bp, у больных животных 30/19/9 bp и у животных - носителей BLAD - мутации 49/30/19/9.

Из протестированных 107 коров , принадлежащих ООО им . Тукая методом ПЦР на носительство BLAD - мутации , нами не выявлено ни одного животного - носителя данного генетического заболевания .

Вывод . При распределении частот аллелей и генотипов гена каппа - казеина у черно - пестро х голштинских коров ООО им . Тукая преобладал аллель А с частотой 0,80 и генотип АА с частотой 63,6%. Частота генотипа ВВ была низкой – 2,8%. В изученном стаде преобладал В аллель гена бета - лактоглобулина с частотой 0,59. Среди коров чаще представлен генотип АВ (56,1%). Животных носителей BLAD- мутации не обнаружено .

ЛИТЕРАТУРА: 1. Гончаренко, Г.М. Генетическая структура популяций сельскохозяйственных животных Западной Сибири и использование маркёров в селекции: автореф. дисс. … докт. биол. наук : 06.02.01 / Гончаренко Галина Моисеевна. – Новосибирск, 2009. – 37 с. 2. Патент РФ на изобретение № 2299240 Способ проведение ПЦР / Рамиль Р. Вафин, Раиф Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова И.В., Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров. – Приоритет изобретения 21.02.2005. – Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 20.05.2007. – Бюл. № 14. 3. Патент РФ на изобретение № 2337141 Способ проведение аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина / Рамиль Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, Раиф Р. Вафин. – Приоритет изобретения 25.09.2006. – Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.10.2008. – Бюл. № 30. 4. Хабибрахманова, Я.А. Полиморфизм генов молочных белков и гормонов крупного рогатого скота : автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.02.01 / Хабибрахманова Язиля Аминовна. – Лесные Поляны. – 2009. – 19 с. 5. Greer, C.R. PCR amplification from paraffin embedded tissues: Effects of fixative and fixation times / C.R. Greer, S.L. Peterson, N.B. Kiviat, M.M. Manos // American Journal of Clinical Pathology, 1991. – 95: 117-124. 6. Маріуца, А.Е. Популяційно-генетичні механізми адаптації і розповсюдження напівлетальних рецесивних мутацій на прикладі BLAD у великої рогатої худоби: автореф. дис... канд. с.-г. наук: 03.00.15 / Маріуца Алла Ергашівна. – Кieв, 2005. – 22 с. 7. Medrano, J.F. Polymerase chain reaction of bovine β-lactoglobuline genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis / J.F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova // Animal Biotechnology. – 1990. – № 1. – P.73-77. 8. Strzalkowska, N. Effects of k-casein loci polymorphism, cow`s age, stage of lactation and somatic cell count on daily milk yield and milk composition in Polish Black-and-White cattle / N. Strzalkowska [et al.] // Anim. Science Papers and Reports. – 2002. – V. 20. – № 1. – P. 21-35.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КОРОВ ПО ЛОКУСАМ КАППА - КАЗЕИНА , БЕТА - ЛАКТОГЛОБУЛИНА И BLAD- МУТАЦИИ

Ахметов Т . М ., Тюлькин С . В ., Валиуллина Э . Ф . Резюме

В данной работе у коров определены частоты встречаемости генотипов и аллелей каппа - казеина , бета - лактоглобулина и BLAD - мутации . Исследования показали , что частота аллеля А генов каппа - казеина и бета - лактоглобулина составила 0,80 и 0,41, аллеля В – 0,20 и 0,59 соответственно . Не выявлено ни одного животного - носителя мутантного аллеля BLAD - мутации .

STUDYING OF GENOTYPES COWS ON LOCI KAPPA-CASEIN, BETALACTOGLOBULIN AND BLAD-MUTATION

Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Valiullina E.F. Summary

In the given work at cows frequencies of occurrence genotypes and alleles kappa-casein, beta-lactoglobulin, BLAD -mutation are defined. Researches have shown that frequency allele A of kappa-casein and beta-lactoglobulin genes has made 0,80 and 0,41, allele В - 0,20 and 0,59 accordingly. It is not revealed any animal-carrier mutant allele BLAD -mutation.