Гены белков молока и микросателлитные профили в популяциях симментальского скота различного происхождения

Гены белков молока в настоящее время считаются наиболее удобными генетическими маркерами при установлении племенной ценности крупного рогатого скота, а микросателлитные профили животного — ДНК-маркерами, использование которых является одним из перспективных приемов индивидуального контроля происхождения и оценки структуры популяции.

Белки молока представлены двумя основными группами — растворимой фракцией, состоящей из нескольких компонентов (наиболее изученные — α -лактальбумин и β -лактоглобулин), и нерастворимой фракцией, включающей четыре формы казеина — α s1-Cs, α s2-Cs, в -Cs, к -Cs и образующей так называемый казеиновый мицелий. В отличие от других белков к - казеин растворяется в присутствии кальция, благодаря чему непосредственно взаимодействует с ферментом химозином на этапе створаживания при производстве сыра. Известно шесть вариантов гена этого белка — А , B , C , E , F и G (1), и показано, что у коров с аллелем В гена κ -казеина по сравнению с животными — носителями аллеля А сыродельческие характеристики молока выше. Также выявлено, что у коров с генотипом ВВ удой ниже (на 173 кг за лактацию) (2), а содержание белка выше на 0,08 %, чем у животных с генотипом АА . α -Лактальбумин входит в состав лакто-зосинтетазы — фермента, ответственного за синтез лактозы молока. При генотипе ВВ по гену α -лактальбумина удой меньше, чем при генотипе АА и АВ , но процентное содержание жира и белка больше. β -Казеин — основной белок, контролирующий уровень кальция в молоке (3). Обнаружено несколько аллелей гена β-казеина ( A1 , A2 , A3 , B , C , D , E , A2 , A3 ^Mongolie и B2 ), однако в большинстве популяций Bos taurus распространены аллели A1 , A2 , A3 и B . Для молочного скотоводства также представляет интерес ген гормона роста, оказывающий существенное влияние на молочную продуктивность, рост и развитие животных. Различают два аллеля этого гена — V и L (второй соответствует аминокислотной замене валина на лейцин в позиции 126). У коров симментальской породы с генотипом LV отмечали повышение прироста живой массы и качества туши по составу (4).

ДНК-микросателлиты представляют собой короткие тандемно повторяющиеся участки, не несущие кодирующих функций, но обладающие высоким полиморфизмом (5). С их помощью оценивают гетерозиготность, степень инбридинга и эффективный размер популяции, что позволяет снизить вероятность близкородственного спаривания. К преимуществам микросателлитного анализа следует отнести высокую точность и достоверность, возможность проводить мультиплексные тесты (в одной пробе исследуют до 15 маркеров), автоматизировать работу и поставить ее на поток (до 100 образцов в час), а также применять электронную обработку и документирование результатов.

Нашей целью была оценка распределения аллелей генов белков молока, а также изучение микросателлитных профилей животных в популяциях крупного рогатого скота разного происхождения.

Методика. Исследовали три популяции (группы) крупного рогатого скота симментальской породы из хозяйств Орловской и Воронежской областей: I и II — чистопородные животные соответственно отечественной ( n = 74, ОАО «Новокриушанская») и австрийской ( n = 68, ЗАО «Шестаковское») селекции; III — улучшенные животные отечественной селекции со средней долей кровности по голштинам 25 % ( n = 66, «ГПЗ имени XVII партсъезда»). Из индивидуальных проб кожи (ушные выщипы) методом солевой экстракции выделяли ДНК (1). Затем проводили ПЦР-ПДРФ-анализ по четырем генам белков молока ( κ -казеин — CSN3 , α -лактальбумин — LALBA , β -казеин — CSN2 и гормон роста — BGH ) с последующим разделением фрагментов ДНК в 2 % агарозном геле (1). Анализ микросателлитного профиля проводили по семи локусам (BM1818, INRA063, HEL5, ETH225, ILST5, INRA035, ETH10), собранным в три мультиплексные панели, с использованием капиллярного генетического анализатора MegaBacelOOO («Amersham Biosciences», Великобритания). Результаты обрабатывали статистическими методами M. Nei (6) с использованием программ F-stat, PopGene32, MSA_WIN, Phylip и TreeView.

1. Удой за лактацию (кг) у коров изученных групп в зависимости от генотипа по генам белков молока

Ген Генотип по аллелям гена I II III CSN3 AA 3751±133 4782±93 3611±100 AB 3284±99 4858±115 3632±89 BB 3551±223 5012±271 3323±197 LALBA AA 3573±107 4925±95 3610±74 AB 3456±134 4604±113 3451±365 BB — 5168±165 3665±110 CSN2 AA 3524±83 4824±72 3610±68 AB — 4597±518 3539±300 BB — 4639±68 — BGH LL 3551±70 4746±99 3575±76 LV 3510±356 4851±111 3640±138 VV — 4998±221 4230±410 П р и м е ч а н и е. I, II и III — группы (популяции) животных (описание групп см. в разделе «Методика»). CSN2 и CSN3 — соответственно гены β- и κ-казеина, LALBA — α-лактальбумина , BGH — гормона роста. Прочерк означает отсутствие данных.

Результаты. Наибольшую частоту встречаемости желательного аллеля В гена κ -казеина отмечали у животных отечественной селекции (36,3 %), благоприятного для проявления признаков жирности и молочности аллеля В гена α -лактальбумина — у коров австрийской селекции (27,4 %), а у голштинизированных животных частота аллеля В гена LALBA оказалась наименьшей (12,5 %) (рис. 1). Частота аллеля В гена β -казеина была низкой в изученных популяциях, причем у животных отечественной селекции (I группа) аллель В гена CSN2 не обнаружили. По гену гормона роста аллель L во всех группах превалировал, при этом в наибольшей степени минорный аллель V был распространен в популяции животных австрийской селекции.

Рис. 1. Частота встречаемости аллелей (%) генов к -казеина ( CSN3 ) , а -лактальбумина ( LALBA ) , в-казеина ( CSN2 ) и гормона роста ( BGH) у коров симментальской породы разного происхождения: I, II и III — анализируемые группы (популяции) животных (описание групп см. в разделе «Методика»); а, б — соответственно аллели А , В (для гена BGH — аллели L , V ).

Однозначного влияния гена κ -ка-зеина на удой не выявили (табл. 1). Следует отметить лишь тенденцию повышения этого показателя у чистопородных животных отечественной селекции (I группа) и улучшенных (III груп-па) с аллелем А ; во II группе по этому признаку выделялись животные с генотипом ВВ .

Для гена α -лактальбумина отмечали наибольшие удои: в I группе — у животных, гомозиготных по аллелю А , во II и III — гомозиготных по аллелю В . Для гена β -казеина по удоям выделялись животные II и III групп с генотипом АА .

В отношении гена гормона роста оказалось, что исследуемый показатель был выше у животных II и III групп с генотипом VV ; в I группе у животных с генотипом LL удои были выше на 41 кг по сравнению с коровами — носителями генотипа LV .

2. Показатели качества молока у коров изученных групп за лактацию в зависимости от генотипа по генам белков молока

Ген	Генотип по аллелям гена	Жирность, %			Содержание белка, %
		I	II	III	I	II
CSN3	AA	3,69±0,04	3,69±0,03	3,89±0,01	3,32±0,03*	3,27±0,02
	AB	3,69±0,04	3,76±0,05	3,88±0,01	3,20±0,04	3,38±0,03
	BB	3,74±0,04	3,72±0,13	3,84±0,06	3,25±0,05	3,42±0,06
LALBA	AA	3,70±0,03	3,73±0,04	3,89±0,01	3,28±0,03	3,34±0,02
	AB	3,69±0,03	3,72±0,04	3,93±0,03	3,23±0,03	3,29±0,03
	BB	—	3,53±0,05	3,83±0,03	—	3,23±0,07
CSN2	AA	3,70±0,02	3,70±0,03	3,88±0,01	3,26±0,02	3,31±0,02
	AB	—	4,06±0,08	3,87±0,06	—	3,34±0,15
	BB	—	3,71±0,09	—	—	3,23±0,04
BGH	LL	3,69±0,02	3,90±0,04	3,88±0,01	—	3,33±0,02
	LV	3,88±0,11	3,72±0,04	3,88±0,02	—	3,13±0,04
	VV	—	3,78±0,08	3,92±0,03	—	3,28±0,03
П р и м е ч а н	и е. То же, что в таблице 1.

При оценке влияния четырех изученных генов на показатели качества молока (табл. 2) было выявлено, что по содержанию жира в молоке среди коров I группы животные с генотипом ВВ по гену CSN3 превосходили носителей аллеля А ; во II группе жирность молока была выше у коров — носителей аллеля В , в III группе, напротив, показатель снижался в ряду генотипов AA — AB — BB .

В I и II группах у животных с генотипом АА по гену LALBA жирность молока была выше, а в III группе наблюдали более высокие значения этого показателя у носителей аллеля А .

Животные II группы с генотипом LL по гену гормона роста BGH превосходили носителей аллеля V по указанному признаку, а у голштинизированных коров III группы наибольшее значение показателя отмечали у особей с генотипом VV .

При изучении влияния исследуемых генов на содержание белка в молоке в двух группах чистопородных животных оказалось, что у коров I группы с генотипом АА по гену CSN3 этот показатель выше, чем у животных, несущих аллель В ; во II группе имела место обратная тенденция — животные с генотипом ВВ превосходили таковых с генотипами АВ и АА соответственно на 0,04 и 0,15 %. Генотип АА по гену LALBA положительно влиял на содержание белка в молоке у коров обеих исследованных популяций.

При анализе профилей по семи изученным микросателлитным локусам оказалось, что среднее число аллелей на локус варьировало от 4,28±1,60 (III группа) до 4,85±1,67 (I группа) и в целом по всей популяции составляло 5,85±2,19 (различия между группами были недостоверны).

Фактическая степень гетерозиготности, рассчитанная по семи локусам, во всех исследованных группах была выше 50 % (в I, II и III — соответственно 57,9; 55,9 и 55,4 %) (табл. 3.). Достоверных различий между Het ф _акт. и H_теор. в группах выявлено не было, что свидетельствует о генетическом равновесии исследованных популяций. Степень гетерозиготности по отдельным локусам в группах варьировала от 24,24 до 72,97 % и по большинству локусов незначительно отличалась от теоретически ожидаемой. Следует отметить лишь существенно более низкую степень гетерозиготности по локусу INRA035 во всех группах, локусу ETH225 во II группе и локусу ETH10 в III группе.

3. Фактическая (Het ф _акт.) и теоретически ожидаемая (Het_теор.) степень гетерозиготности по микросателлитным локусам в популяциях (группах) симментальского скота разного происхождения

Микросател-литный локус	I		II		III		Всего
	Het факт.	Het теор.	Het факт.	Het теор.	Het факт.	Het теор.	Het факт.	Het теор.
BM1818	0,6757	0,6585	0,6471	0,7197	0,6061	0,6653	0,6442	0,6936
INRA063	0,6486	0,6180	0,6471	0,5688	0,5455	0,6492	0,6154	0,6233
HEL5	0,6486	0,6315	0,6765	0,6856	0,7273	0,6244	0,6827	0,6557
ETH225	0,7297	0,7637	0,4412	0,6241	0,7879	0,7741	0,6538	0,7432
ILST5	0,3514	0,2896	0,5294	0,4567	0,5152	0,3825	0,4615	0,3844
INRA035	0,3243	0,4606	0,4118	0,4503	0,2424	0,3549	0,3269	0,4314
ETH10	0,6757	0,5570	0,5588	0,6107	0,4545	0,3728	0,5673	0,5283
Среднее	0,5792±	0,5684±	0,5588±	0,5880±	0,5541±	0,5462±	0,5646±	0,5800±
	±0,1672	±0,1539	±0,1047	±0,1043	±0,1807	±0,1714	±0,1278	±0,1355
П р и м е ч а н и е	. Описание популяций (групп) см.			в разделе «Методика». Het теор. рассчитана по M.				Nei (6).

Рассчитанные генетические расстояния и построенные на их основе дендрограммы (рис. 2) показали отсутствие существенных генетических различий между исследуемыми группами скота. Как и ожидалось, филогенетически наиболее обособленными оказались животные австрийской селекции (II группа) (значения соответствующих генетических расстояний — 0,0412 и 0,0465). Между чистопородными отечественной селекции и улучшенными животными (I и III группы) генетических различий практически не было (0,0135).

Полученная филогенетическая структура полностью согласуется с происхождением и направлением селекции исследованных групп скота, однако она отражает степень филогенетического родства без учета влияния селекции животных на продуктивность. Соответствующие расчеты генетических расстояний по генам CSN3 , LALBA , CSN2 и BGH (см. рис. 2, Б) показали наибольшую близость между популяциями голштинизированных симменталов отечественной селекции (III группа) и чистопородных симменталов австрийской селекции (II группа). Направление отечественной селекции (I группа) было отличным от такового в других группах.

[I группа

I группа

111 группа

I группа

III группа

II группа

Рис. 2. Дендрограммы изученных популяций крупного рогатого скота симментальской породы разного происхождения: А и Б — построены соответственно без учета продуктивности и в зависимости от продуктивности. Для построения дендрограмм использовалась программа Phylip; описание групп (популяций) животных см. в разделе «Методика».

Таким образом, показано наличие двух вариантов каждого из изученных генов белков молока и гормона роста у животных трех исследованных популяций крупного рогатого скота симментальской породы. Исключением было отсутствие аллеля В гена β-казеина у коров I группы (чистопородные отечественной селекции). Полученные нами данные о положительном влиянии аллеля А гена κ-казеина на удои согласуются с имеющимися в литературе (7). Выявлено превосходство носителей аллеля А этого гена по показателю жирности молока. В то же время полученные нами результаты оценки влияния гена α-лактальбумина на продуктивность противоположны данным S. Kaminski (2). У животных с генотипом ВВ по LALBA молочная продуктивность выше, чем у носителей аллеля А, но при генотипе АА выше содержание белка и жира в молоке. Генотип АА по гену β-казеина и генотип VV по гену гормона роста наиболее предпочтительны по величине удоя, а жирность молока у коров с аллелем L гена гормона роста выше, чем у животных, в генотипе которых имеется аллель V. Выбранные для анализа микросателлитные локусы обладают достаточно высокой степенью полиморфизма (среднее число аллелей на локус — от 4,28 до 4,85), что делает их удобным инструментом для характеристики и управления генетической структурой популяций, а также критерием оценки генетических различий между группами скота симментальской породы. Фактическая степень гетерозиготности, рассчитанная по семи локусам, во всех исследованных группах превышала 50 %, что позволяет предполагать более легкую адаптацию животных к условиям окружающей среды. Вероятно, это один из факторов, обеспечивших удовлетворительную акклиматизацию животных австрийской селекции на территории России. Сравнительный анализ генетической структуры по микросателлитам и генам белков молока показал, что если по происхождению, как и ожидалось, наиболее близкородственными являются чистопородные и улучшенные животные отечественной селекции, то по продук- тивности и, следовательно, по направлению селекции наиболее близки улучшенные животные отечественной и животные австрийской селекции.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   З и н о в ь е в а Н.А., Г л а д ы р ь Е.А., Э р н с т Л.К. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. Дубровицы, 2002.

• 2.   K a m i n s k i S. Polymorphism of milk protein genes in coding and regulatory regions and their effects on gene expression and milk performance traits. In: Gene polymorphisms

  affecting health and production traits in farm animals. Jastrz e biec, Poland, 2003: 117-120.

• 3.    V a n d e n B e r g G., E s c h e r J.T.M., d e K o n i n g P.J. e.a. Genetic polymorphism of k-casein and β-lactoglobulin in relation to milk composition and processing properties. Neth. Milk Dairy J., 1992, 46: 145-151.

• 4.    K e m e n e s P., d e A l m e i d a R e g i t a n o L.C., d e M a g a l h ã e s R o s a A. J. e.a. κ -Casein, β -lactoglobulin and growth hormone allele frequencies and genetic distances in nelore, gyr, guzer a , caracu, charolais, canchim and santa gertrudis cattle. Genet. Mol. Biol., 1999, 22(4): 539-541.

• 5.    C u r i R.A., L o p e s C.R. Evaluation of nine microsatellite loci and misidentification paternity frequency in a population of Gyr breed bovines. Brazil J. Vet. Res. Anim. Sci.,

  2002, 39(3): 129-135.

• 6.   N e i M. Analysis of gene diversity in subdivided population. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1973, 70: 3321-3323.

• 7.   B r o p h y B., S m o l e n s k i G., W h e e l e r T. e.a. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein. Nature Biotech., 2003, 21: 157

ГНУ Всероссийский НИИ животноводства Россельхозакадемии,