Гетерогенность сибирских популяций фузариоидных грибов по фитопатогенным свойствам

Acknowledgments : the study has been supported by grant № 23-26-00052 of the Russian Science Foundation.

Введение. Фузариоидные грибы (род Fusarium sensu stricto и близкородственные рода) являются значимыми фитопатогенами зерновых культур и встречаются во всех зерносеющих регионах. Они вызывают заболевания различных органов у широкого круга растений-хозяев, накапливаются в сельскохозяйственной продукции и контаминируют ее микотоксинами. Заболевания могут протекать бессимптомно (при заражении растения видами F. poae, F. Sporotri-chioides и F. tricinctum) либо с видимыми проявлениями в виде окрашенного спороношения (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum). Патологическое действие фузариоидных грибов на растение определяется наличием и степенью проявления факторов фитопатогенности, которые существенно варьируют у различных видов и популяций. Внутривидовой полиморфизм фи-топатогенных грибов и влияние почвенноклиматических условий способствуют отбору экологически пластичных и патогенных популяций, которые доминируют в структуре фитопа- тогенного комплекса и вытесняют виды с невысокой встречаемостью [1–5].

Цель исследования – изучение внутривидовой гетерогенности по фитопатогенным свойствам у сибирских штаммов фузариоидных грибов.

Задачи : определить фитотоксические свойства метаболитов грибов на семенах и проростках лиственницы и пшеницы; исследовать динамику фитотоксической активности на проростках кукурузы у наиболее активных штаммов; оценить гетерогенность по фитопатогенным свойствам у доминирующего в регионе вида.

Объекты и методы. Объектами исследования служили 52 изолята фузариоидных грибов (Fusarium, Neocosmospora) из коллекции лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН. Грибы изолировали в чистую культуру из образцов Triticum aestivum L. и Hordeum vulga-re L. с признаками заболевания (колос, зерновки, стебель, корни). Первичную идентификацию осуществляли на основании культурально- морфологических признаков [6–10], с обязательной молекулярно-генетической верификацией – секвенирование ДНК гена фактора элонгации трансляции (TEF-1α) и второй по величине субъединицы РНК-полимеразы (RPB2) [10]. На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей 31 изолята F. sporotrichioides, включая 1 новый сибирский штамм [11], секвенированных по одному локусу. Последовательности выровнены по таксону Atractium stilbaster [10].

Фитопатогенные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки на проростках пшеницы сорта Красноярская-12. Исследуемые штаммы высевали на картофель-но-сахарозный агар (КСА) в чашки Петри и культивировали их в течение пяти суток при 24 °С в темноте. Семена поверхностно стерилизовали 70 % этанолом в течение 3 мин и замачивали в стерильной воде на 24 ч при 24 °С для набухания. На мицелий гриба раскладывали набухшие семена в количестве 10 штук в трехкратной повторности, контролем служили семена, разложенные на поверхности стерильного КСА. Чашки в течение 7 сут выдерживали в темноте при 24 °С, после чего измеряли длину появившихся ростков (мм) и регистрировали степень их поражения по четырехбалльной шкале: 0 баллов – здоровый росток; 1 балл – точечный некроз ткани; 2 балла – некроз около 50 % площади ткани; 3 балла – гибель.

Биотестирование метаболитов проводили на семенах пшеницы сорта Тулунская-12, Larix sibirica Ledeb . и проростках Zea mays L. сорта Лакомка [6]. Иммуноферментный анализ Т2 фу-зариотоксина проводили стандартным методом (ГОСТ Р 52471-2005) на базе Краевой ветеринарной лаборатории. Культуры грибов выращивали на стерильном рисе в течение 10 сут при 25 °С.

Fusarium sporotrichioides 313PT15AB

Fusarium sporotrichioides FS2f

Fusarium sporotrichioides strain F95

Fusarium sporotrichioides strain 499E

Fusarium sporotrichioides strain 42HS

Fusarium sporotrichioides 087

Fusarium sporotrichioides NRRL 52934

Fusarium sporotrichioides NRRL 53434/2616/11

Fusarium sporotrichioides FspCh4

Fusarium sporotrichioides FspChl

Fusarium sporotrichioides FOEP 40.11159

Fusarium sporotrichioides CBS 462.94

Fusarium sporotrichioides 159H -

Fusarium sporotrichioides 14-OP-FUS-002

Fusarium sporotrichioides 474E -

Fusarium sporotrichioides MRC 1704

F30 Fusarium sporotrichioides Siberia

Fusarium sporotrichioides ЗОН

Fusarium sporotrichioides AMLB FUS126

Fusarium sporotrichioides F110

Fusarium sporotrichioides FUS-CAR008

Fusarium sporotrichioides ICMP: 11358

Fusarium sporotrichioides KG435

Fusarium sporotrichioides LMSA 1.09.114

Fusarium sporotrichioides LMSA 1.09.115

Fusarium sporotrichioides MRC 2911

Fusarium sporotrichioides MRC 2912

Fusarium sporotrichioides NRRL 3299

Fusarium sporotrichioides NRRL 52728

Fusarium sporotrichioides NRRL 52930

Fusarium sporotrichioides 109MPT18AB

Atractium stilbaster CBS 410.67

Рис. 1. Филогенетическое дерево на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма F30 и последовательностей Fusarium sporotrichioides из NCBI GenBank с использованием праймеров TEF-1α. Бутстреп-значения более 50 % указаны рядом с кластерами. В качестве внешней группы использовали Atractium stilbaster (Link)

27,1–64,1 %. Семена пшеницы оказались более чувствительными к метаболитам Fusarium poae (Peck) Wollenw ., Fusarium acuminatum Ellis & Everh . и Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) по сравнению с лиственницей сибирской.

Таблица 1

Комплекс видов / вид	Количество штаммов	Лабораторная всхожесть семян, % от контроля*
		Triticum L.	Larix sibirica
Fusarium sambucinum s	pecies complex
F. sambucinum	4	64,5–103,7**	61,3–101,2
F. sporotrichioides	12	14,2–51,4	17,9–54,1
F. poae	4	47,9–74,1	69,1–92,3
F. culmorum	5	29,5–64,1	49,8–78,1
Fusarium tricinctum species complex
F. acuminatum	6	43,1–75,4	57,7–82,3
F. avenaceum	8	27,3–58,4	30,9–63,3
Fusarium oxysporum species complex
F. oxysporum	5	19,4–54,2	16,9–57,3
Fusarium fujikuroi species complex
Fusarium sp.	4	29,3–61,3	25,5–64,2
Neocosmospora
N. solani	4	27,1–63,5	24,2–68,1

*Всхожесть семян в контроле в расчетах принята за 100 %; 0–30 % – высокая степень фитотоксичности; 30–70 % – средняя; более 70 % – слабая.

**Минимальное и максимальное значения в пределах выборки.

Лабораторная всхожесть семян злаковых и хвойных растений под действием метаболитов сибирских штаммов рода Fusarium

Пролонгированный фитотоксический эффект проявился в ингибировании развития стебля и корня (рис. 2). На семисуточных проростках пшеницы ингибирование роста стебля варьировало от 3 до 46 %, главного корня – от 2 до 73 % относительно контроля. Максимальная фитотоксичность характерна для изолятов F. sporotrichioides. Штаммы F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC угнетали развитие в равной степени стебля и корня; N. solani и F. oxysporum сильнее ингибировали корневую систему. На 14-суточных проростках L. sibirica ингибирование роста стебля составило от 8 до 63 %, корневой системы – от 14 до 75 %. Максимальной токсигенностью обладали метаболиты F.oxysporum , F. avenaceum, N. solani, F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC.

Динамику фитотоксической активности исследовали на двухсуточных проростках Z. mays , используя фильтраты фитотоксичных культур, полученные на токсигенной среде в течение 49 сут (рис. 3).

Для всех исследуемых штаммов характерна высокая фитотоксичность – средние показатели ингибирования роста корней варьировали от 52 до 89 %. Выявлены внутривидовые различия по степени фитотоксической активности и динамике накопления метаболитов. Например, штаммы F. sporotrichioides были разделены на три группы. Штаммы первой группы (50 % исследованных культур) оказывали сильное фитотоксическое действие (более 50 % ингибирования роста) в течение всего периода с постепенным увеличением фитотоксичности до 79–98 %. Штаммы из второй группы (30 %) проявили сначала умеренное фитотоксическое действие (10–25 %), а затем выраженное (39–81 %). Третья группа (20 %) представлена штаммами, которые в начальный период стимулировали развитие корней, но затем отмечено существенное ингибирование (58– 87 %). Внутривидовая гетерогенность по фитотоксичности также выявлена у F. avenaceum (ингибирование роста корней 38–74 %), F. Oxys-porum (47–98 %), N. solani (58–83 %) и F. fujikuroi SC (44–98 %).

■ стебель □ главный корень

Рис. 2. Морфометрические показатели проростков Triticum aestivum под влиянием метаболитов сибирских штаммов фузариоидных грибов

■ Е avenaceum ПК oxysporum nN. solani OF. sporotrichioides SFfujikuroi SC

Рис. 3. Динамика фитотоксической активности сибирских штаммов фузариоидных грибов в отношении корней Zea mays

Для изолятов вида F. sporotrichioides , как наиболее распространенного на исследуемой территории [11], был проведен иммунофер-ментный анализ на наличие Т2-фузариотоксина. Токсин выявлен во всех исследуемых культурах, однако его концентрация варьировала между отдельными штаммами в пределах вида и среди моноспоровых культур одного штамма (табл. 2).

Максимальная концентрация Т-2 фузарио-токсина отмечена для штамма Fs11, выделенного из зерновок ячменя. Содержание микотоксина у его моноспоровых культур соответствовало уровню родительского штамма (5,3– 5,4 мг/кг) либо было существенно ниже (0,94– 2,74 мг/кг). Уровень синтеза токсинов у штаммов, выделенных из зерновок пшеницы, был меньше и находился в пределах 0,05–0,84 мг/кг.

Содержание Т-2 фузариотоксина в культурах Fusarium sporotrichioides , выращенных на рисовом зерне

Таблица 2

Штамм	Источник выделения	Концентрация токсина (мг/кг), Х ср. ± m
Fs11	Зерновки ячменя сорта Ача	5,50±0,89
Fs11-3	Моноспоровые культуры штамма Fs11	5,40±0,87
Fs11-9		5,30±0,86
Fs11-10		2,74±0,44
Fs11-4		0,94±0,15
Z11-1	Зерновки пшеницы, сорт Тулунская-12	0,84±0,14
Z31-5	Зерновки пшеницы, сорт Красноярская-12	0,81±0,13
Z37-1	Зерновки пшеницы, селекционная линия «К64-2»	0,14±0,02
Z12	Зерновки пшеницы, сорт Мана-2	0,05±0,014

На следующем этапе оценивали фитопато-генные свойства живых культур F. Sporotri-chioides. Исследование проводили на проростках пшеницы сорта Красноярская-12, оценивая длину проростка (патогенность) и наличие некроза корней (агрессивность) по сравнению с контролем. Все исследуемые штаммы достоверно ингибировали развитие проростков по сравнению с контролем: 70 % штаммов снижали длину на 50–79 % (средний показатель группы 67 %); 30 % штаммов – в диапазоне 36–49 % (средний показатель 43 %) (рис. 4). Отмечено наличие некроза в тканях с максимумом до 1,6 балла (по трехбалльной шкале); при этом более чем у 50 % культур степень некроза составила 0,9–1,6 балла.

Для токсигенного штамма Fs11 F. Sporotri-chioides получены 16 моноконидиальных культур, фитопатогенность которых исследовали аналогичными методами. Установлено, что у 81 % клонов показатели фитопатогенности выше, чем у родительского штамма, длина проростков уменьшилась на 84–95 % по сравнению с контролем. Более 50 % клонов вызывали некрозы корней от 1,8 до 2,6 балла, что превышает исходный показатель в среднем в 1,6 раза. У 19 % моноспоровых культур показатели патогенности достоверно не отличаются от родительского штамма.

Рис. 4. Фитопатогенность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides на проростках Triticum aestivum

Заключение. Сибирские штаммы фузарио-идных грибов в различной степени ингибируют лабораторную всхожесть семян и замедляют ростовые процессы злаковых и хвойных растений. Максимальная фитотоксичность отмечена для видов F. sporotrichioides и F. oxysporum , в меньшей степени фитотоксичны F.avenaceum, N. solani и неидентифицированные изоляты F. fujikuroi SC . Выявлены внутривидовые различия по динамике накопления метаболитов и фитотоксичности в отношении проростков Z. mays для видов F.sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N.solani и F. fujikuroi SC, при этом для всех штаммов фитотоксический эффект возрастал (до 98 %) при увеличении времени культивирования .

Максимальная концентрация Т-2 фузарио-токсина (до 5,5 мг/кг) отмечена у штамма F. sporotrichioides, выделенного из ячменя, и его моноспоровых культур, при этом содержание токсина у клонов существенно варьировало (0,94–5,4 мг/кг). Уровень синтеза токсина у остальных штаммов был ниже и составил 0,05– 0,84 мг/кг.

Выявлена внутривидовая гетерогенность F. sporotrichioides по фитопатогенности: при мо-ноконидиальном рассеве выщепляются линии, отличные от природного штамма, преимущественно в сторону увеличения патогенности, что указывает на микроклональную структуру популяции по токсикогенным свойствам и свидетельствует о вероятности появления более агрессивных клонов.